研究背景和目的：宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，高危型人乳头瘤病毒（high risk humanp apillomavirus，hrHPV）是宫颈癌发病的首要病因。hrHPV主要包括16、18、31、33、34、35、39、45、51、52和70型等，在90％以上的宫颈癌组织中可检测到hrHPV，而HPV16型就占了50％以上。高危型HPV的两个早期开放阅读框E6和E7与细胞的恶性转化密切相关，被认为是致瘤基因。细胞生长调节主要由二个肿瘤抑制蛋白执行：p53和视网膜母细胞瘤蛋白pRb。正常情况下，当细胞DNA损伤时，p53蛋白激活下游基因的转录，延迟细胞进入S期，直到DNA完成修复，否则p53激活baxl和fas受体等基因诱导细胞凋亡。但当hrHPV存在时，HPV E6结合p53并通过细胞泛素酶使其快速降解，该降解使P53控制G1、凋亡和DNA修复的活性消失。E7结合并降解肿瘤抑制蛋白pRb为致瘤补充作用。hrHPV的致癌基因E6和E7协同作用导致肿瘤抑制蛋白P53和pRb依赖的细胞周期调节失控，致使细胞恶性转化、发生永生化。然而，流行病学研究显示，虽然生殖器HPV感染很常见，但感染大多数为自限性的，仅有少数感染持续存在，继发为肿瘤。这提示宿主自身的免疫监视功能失调（即发生HPV的免疫逃逸）与宫颈癌的发生发展密切相关。研究表明，白介素-18（Interleukin-18，IL-18）的表达减少在HPV的免疫逃逸机制中起到重要作用。由于IL-18能诱导NK和T细胞分泌高水平的IFN-γ，最初被命名为IFN-γ介导因子（IFN-g-inducing factor，IGIF）。随后的研究发现IL-18还具有其它重要的生物学功能，如增加NK细胞的活性，刺激T细胞增生等，被命名为L-18。IL-18主要由活化的单核巨噬细胞、肝脏的苦否氏细胞产生。IL-18通过刺激NK细胞、T细胞、B细胞和单核细胞表达高水平的IFN-γ。通过Fas配体（FasL）的表达IL-18可增强Fas介导的T细胞增殖、CTL活化和NK细胞的活性。最近的研究也证实IL-18在维持细胞免疫（TH1 response）方面具有重要的作用。因此IL-18被认为是一种极具潜能的抗肿瘤免疫的细胞因子。然而在hrHPV感染的疾病中，IL-18介导的免疫功能明显受损。高危型HPV可通过结合IL-18以及竞争性地与IL-18Rα结合阻断IL-18信号传导等途径使其下游Th1细胞因子的表达下调。例如其下游基因IFN-γ的表达下调，一方面使机体抗病毒功能减弱，另一方面使IFN-γ刺激IL-18分泌的正反馈通路的作用减弱，如此形成恶性循环，不断削弱IL-18的作用，最终使机体细胞免疫功能减弱，HPV持续感染，致细胞转化。因此，我们推测宿主本身IL-18的表达下调会增加hrHPV感染后宫颈癌的发生率，那么研究宿主的IL-18基因序列是否存在突变应可以预测宫颈癌的易感性。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）是人类基因组变异最丰富的一种DNA序列变化形式，主要表现为单个核苷酸的置换。基因组SNPs的关联研究可反映个体表型、疾病易感性的差异，是目前探讨疾病易感性的主要研究方式。IL-18基因的SNPs，对其基因表达有一定的影响。如IL-18E42A突变型的NK0细胞分泌的IFN-γ是野生型IL-18的2倍，且E6或E7癌蛋白均不能抑制其产生IFN-γ的能力。而IL-18上游调控区杨SNPs可影响IL-18的表达。如IL-18表达减低则可使其与HPV竞争能力减弱，使HPV更易与IL-18和IL-18Rα结合，从而阻断IL-18信号传导通路，使其下游Th1细胞因子等基因的表达下调，而利于HPV持续感染。由于细胞免疫功能逐渐的减弱，导致HPV免疫耐受，最终致宫颈上皮细胞转化，可能与宫颈癌的发生和发展有关。为此，我们对IL-18基因的单核苷酸多态性与宫颈癌的关系进行研究，了解IL-18 SNP在宫颈癌人群中的分布；阐明IL-18 SNP位点IL-18 SNP位点rs1946519和rs360718基因型对IL-18表达的影响及其与宫颈癌发生发展的关系，为宫颈癌的风险预测奠定基础。方法：1 HPV16 E6基因沉默对CaSki细胞的影响利用Invitrogen公司在线软件设计HPV16 E6基因（NC₀01526）shRNA序列，退火形成ds oligo，再克隆到pENTR^TM／U6载体的粘性末端，转化TOP10感受态细胞，增菌，质粒DNA抽提并测序鉴定。实验分3组，利用由无毒的细胞蛋白和多聚胺组成的Gene Juice转染试剂将该载体导入CaSki细胞为实验组；同时设CaSki细胞组和假转染组为对照组。在有效沉默HPV16E6表达的基础上，采用RT-PCR和免疫荧光染色方法检测E6基因、P53和IL-18mRNA和蛋白的表达水平。进一步探讨HPV16E6沉默对CaSki细胞P53和IL-18表达的影响。2 IL-18基因SNPs位点筛选常规方法对原发性宫颈癌患者26例和正常人群20例的外周血单个核细胞DNA进行抽提；自行设计8对引物，对IL-18基因5′端和6个外显子（长约5kb）进行PCR，产物采用DNA测序方法进行分析，对宫颈癌这一特定人群IL-18SNPs进行筛选，为进一步研究IL-18SNPs和宫颈癌的关系奠定基础。3 IL-18基因SNPs位点的分型常规方法对107例原发性宫颈癌患者和80名正常人群外周血进行基因组DNA抽提；自行设计2对引物和探针，等位基因特异性杂交TaqMan探针技术对我们前期筛选的IL-18基因rs360718和rs1946519位点进行TaqMan和MGB探针荧光定量PCR分型，对IL-18基因rs360718和rs1946519位点与宫颈癌易感性进行研究。4 IL-18基因SNPs不同组合基因型PBMC的生物免疫学功能检测Ficoll密度梯度离心法分离rs1946519和rs360718组合基因型个体的外周血单个核细胞，将其放入10％小牛血清RPMI 1640培养基中体外培养，同时加入CaSki-Ag或LPS刺激细胞增殖，24h后收集单个核细胞。未加刺激的PBMC作为阴性对照。采用流式细胞仪计数CD14阳性细胞，ELISA鉴定IFN-γ蛋白的分泌水平，探讨rs1946519和rs360718组合基因型个体的外周血单个核细胞的生物免疫学功能。结果1测序结果显示pENTR^TM／U6-HPV16E6-shRNA为阳性克隆；RT-PCR结果显示pENTR^TM／U6-HPV16E6-shRNA转染的CaSki细胞组E6 mRNA水平显著低于CaSki细胞组和假转染组（P＜0.001），而IL-18和P53 mRNA水平显著高于CaSki细胞组和假转染组（P＜0.01）。2通过测序分析，我们在IL-18基因5′端2kp和6个外显子区域内共筛查出7个候选SNPs，频率约0.14％，其中rs1946518和rs1946519的SNPs基因型在宫颈癌和正常人之间存在显著差异（P＜0.001），且二者存在连锁关系；另有三个位点rs360719、rs360717和rs360718也存在连锁关系，可能与宫颈癌呈负相关，但无统计学差异（P＞0.05）；位于E4的rs11547404和1个未登陆的SNP分别在一例病人中检测到。3特异探针分型结果显示，宫颈癌患者组与正常对照组IL-18 rs360718各基因型TT、GT、及其G、T等位基因频率比较无显著性差异（P＞0.05）；宫颈癌患者组与正常对照组IL-18 rs1946519各基因型AA、AC、CC及A、C等位基因频率差异显著（P＜0.01），AC、CC及C基因的患病风险增加（OR值分别为2.883，2.750和1.611）。宫颈癌与正常人群中rs1946519和rs360718位点存在6种组合方式，比较发现IL-18 rs1946519和rs360718位点组合AC+TT基因型频率较正常对照组高，有显著性差异（P＜0.05，OR=2.500）。其它各型在二组间比较无统计学意义。4我们对不同SNPs组合的PBMC的CD14⁺和IFN-γ表达的进行了统计分析。析因方差分析CD14⁺细胞率结果显示，对照组、CaSki-Ag刺激组和LPS刺激组之间CD14⁺细胞率的差异有统计学意义（F=21.317，P＜0.001），不同组合基因型与不同组间CD14⁺细胞率的差异也有统计学意义（F=9.424，P＜0.001），实验组与组合基因型之间存在显著的交互作用（F=2.972，P＜0.05）。我们对同实验组不同组合基因型间进行了单因素方差分析，结果表明组合基因型AATT和AATG组间刺激后CD14阳性细胞率显著增加；与对照组或CaSki-Ag刺激组相比，LPS刺激组CD14阳性细胞率显著增加；而组合基因型ACTG、CCTG和ACTT刺激后CD14阳性细胞率增加不显著。对相同组合基因型不同组间进行单因素方差分析，结果表明在刺激前，CD14阳性细胞率增加不显著。而在刺激后，各组合基因型CD14阳性细胞率显著增加。两两比较，AATT与AATG，ACTT与CCTT，ACTT与ACTG，ACTG与CCTT差异不显著；而AATT与ACTT，ACTT与CCTT、ACTG或AATG，CCTT与ACTG比较有显著性差异。诱导IFN-γ的产生是IFN-γ诱导因子—IL-18最重要的生物学功能，为了解IL-18不同组合基因型的生物学功能，我们也对各组PBMC上清中的IFN-γ进行检测，结果显示同CD14一致。结论1成功构建了HPV16E6基因shRNA表达载体，且该载体能特异性沉默CaSki细胞中整合的HPV-16 E6基因表达，随HPV16 E6 mRNA降解，P53的表达明显增加，证明HPV病毒可通过作用于P53而致宫颈损伤。同时，干扰E6后，转染组CaSki细胞IL-18mRNA的表达也显著增加，表明HPV感染也可下调免疫刺激细胞因子IL-18的表达，这可能是hrHPV逃逸机体的免疫监视致宫颈损伤的另一个机理。2采用小样本对特定人群IL-18基因进行测序可有效地筛选出候选SNPs。初步证实宫颈癌与IL-18基因上游调控区rs1946518和rs1946519SNPs有一定关系。为后续利用SNPs标记进行宫颈癌风险预测提供了研究基础。3 IL-18 rs360718等位基因变异与宫颈癌的易感性关系不大；IL-18 rs1946519与宫颈癌的发生有密切关系，具有AC和CC基因型的人发生宫颈癌的危险性相对较高。4 IL-18 rs1946519和rs360718组合基因型为AATT和AATG的个体单核巨噬细胞对病原微生物的刺激能产生有效的免疫应答；而组合基因型为ACTG、CCTG和ACTT的个体单核巨噬细胞，刺激后免疫应答低下。IL-18上游调控区rs1946518 A→C突变的个体，单核细胞对病原微生物的反应能力减弱，IL-18主要诱导因子IFN-γ产生降低。rs1946518 A→C突变的个体清除hrHPV的能力可能下降，而对宫颈癌的易感性增加。主要创新点：1利用RNAi技术沉默HPV16 E6基因，获得了一个新的HPV16 E6基因沉默的有效位点，为RNAi数据库提供了新的有效作用位点。2首次对宫颈癌患者IL-18基因上游调控区和6个外显子的SNP进行筛选和分型，目前国内外尚未见类似报道。3首次证明IL-18基因上游调控区rs1964519A→C颠换的个体患宫颈癌的风险增高。