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长链二元酸(Long chain dicarboxylic acid)是一类用途极其广泛的脂肪族二羧酸。热带假丝酵母(Candida tropicalis)是可以通过发酵脂肪酸和烷烃来生产长链二元酸(DCA)的高产微生物。本研究以能够催化油脂生产长链二元酸的C.tropicalis 1798为研究对象,利用大肠杆菌中的mazF基因作为反向筛选标记构建了自杀载体pPICPJm,以促进热带假丝酵母甘油利用的基因gk、调控脂肪酸β-氧化过程的基因CRAT以及ω-氧化过程中的关键酶P450为目标,在通过分子生物学技术构建的基因无痕编辑系统基础上对gk基因和细胞色素P450酶、NADH-细胞色素P450还原酶的启动子基因进行替换,对肉毒碱乙酰转移酶基因CRAT作单拷贝敲除。论文的主要结果如下:(1)获取来源于大肠杆菌Escherichia coli中的毒素蛋白基因mazF基因,解脂耶氏酵母Candida lipolytica 1457中的启动子基因pGAL,通过重叠PCR方法构建重叠片段pGAL-mazF,将其连同抗性标签Kan~r基因通过无缝克隆手段连接至载体pPICzαA构建成自杀质粒pPICPJm作为热带假丝酵母分子改造过程中的基因无痕编辑载体。将自杀质粒pPICPJm电转化至C.tropicalis并通过抗生素G418抗性及PCR筛选后,分别在含有半乳糖浓度为0 g/L,5 g/L和10 g/L的平板上划线培养,结果显示10 g/L的半乳糖能够有效抑制C.tropicalis-pPICPJm的生长,因此后续以10 g/L的半乳糖筛选发生第二次单交换的重组子。(2)在自杀质粒pPICPJm的基础上,将C.tropicalis 1798作为出发菌株,通过基因重组的手段,构建了工程菌C.tropicalis gkPr,通过抗生素G418抗性及PCR筛选,证实gk基因启动子替换工程菌C.tropicalis gkPr构建成功。经发酵验证显示,启动子基因替换菌C.tropicalis gkPr甘油利用率提升了56.1%,表明启动子替换能促进C.tropicalis 1798对甘油吸收利用,从而为热带假丝酵母发酵供能。以玉米油为底物进行发酵时还发现重组菌产十二碳二元酸的量比出发菌提高32.7%。(3)利用PCR技术扩增得到C.tropicalis的同源臂CRATpF和CRATpR,重叠PCR拼接后,通过无缝克隆技术连接至自杀质粒pPICPJm,在C.tropicalis gkPr基础上运用电转化法进行同源片段重组,构建了CRAT基因单拷贝缺失菌C.tropicalis gkPc。通过抗生素G418抗性和PCR实验的筛选,证实了CRAT基因单拷贝缺失菌C.tropicalis gkPc构建成功。摇瓶实验表明,单拷贝缺失菌C.tropicalis gkPc十二碳二元酸产量较原始菌株C.tropicalis 1798十二碳二元酸产量升高,产量为7.13 g/L。表明由于CRAT基因的单拷贝敲除,减弱了细胞内脂肪酸的消耗,导致产酸水平的提升。(4)基于以上的研究,以细胞色素P450酶和NADPH-细胞色素P450还原酶为目标,在C.tropicalis gkPc的基础上,对细胞色素P450和NADPH-细胞色素P450还原酶的启动子基因进行了替换,构建了启动子替换工程菌C.tropicalis GCPP。摇瓶发酵显示重组菌株C.tropicalis GCPP十二碳二元酸产量为11.39 g/L,是原始菌产量的2.8倍,5 L发酵罐发酵显示C.tropicalis GCPP十二碳二元酸产量达到了35.64 g/L。