目的:糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种常见的代谢性疾病,已严重的危害到人类健康。据世界卫生组织(WHO)报告,我国的糖尿病人数居世界第二,在未来的十年内,由糖尿病带来的经济损失,中国居世界首位。糖尿病高致残和高死亡的主要原因是糖尿病慢性并发症,而在眼部主要表现为低视力和高致盲率。糖尿病性白内障(diabetic cataract, DC)是最重要的致盲因素。由于DC的机制尚不清楚,因此,DC机制的研究对降低致盲率和提高患者的生活质量有重要的意义。目前,氧化应激(oxidative stress)被公认为是DC发病机制的中心环节。氧化应激反应的关键酶是诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS),已证实核转录因子NF-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是调控iNOS转录最重要的反式作用因子,能增强iNOS的转录活性,产生过量的一氧化氮(nitric oxide,NO)和超氧阴离子(superoxide anion,O2-.)。NO与O2-.快速反应,生成氧化能力较H2O2大2000倍的过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-),造成氧化损伤。本小组前期研究表明,ONOO-参与介导DC的发生与发展。ONOO-可引起蛋白质中酪氨酸残基硝基化,硝基化后的蛋白质其结构和功能会发生改变,而硝基酪氨酸(nitrotyrosine, NT)则是蛋白质硝基化的一个特异性检测标志。NF-κB家族包括p50, p52, p65 (RelA), c-Rel和RelB五个成员。它们中只有p65、c-Rel和RelB含有转录激活结构域,可与共激活因子结合,激活基因转录。NF-κB普遍以p50/ p65异二聚体的形式存在于细胞浆中,激活后NF-κB转位入核,结合顺式作用元件,p65通过招募共激活因子p300共同调控基因转录。p300在不同组织含量不同,其蛋白含量的改变可调节与转录因子的相互作用,对调控基因表达有重要影响。因此,p300对NF-κB p65的激活活性有重要作用。研究表明,在血管内皮细胞中,高糖刺激增强p300与NF-κB p65的相互作用,使NF-κB的转录活性增强。在糖尿病大鼠肾脏中,p300的mRNA及蛋白表达均升高,并增强NF-κBp65的转录活性。而在眼部的晶状体中,晶状体上皮细胞是代谢、合成、转运过程的中心,也是最先受损伤的靶细胞。在DC的发病过程中,晶状体上皮细胞中的p300与NF-κB是否起着关键作用呢?已有报道,高糖致白内障大鼠晶状体内NF-κB蛋白表达量增高。而在DC中对p300蛋白作用的研究未见报道。那么,在高糖刺激的人晶状体上皮细胞(SRA01/04)中,细胞核内p300蛋白含量如何?是否能引起p300与NF-κB的硝基化?硝基化后对p300与NF-κB结合活性的影响如何?是本研究拟解决的核心问题。本实验用高糖、SIN-1(ONOO-供体)、FeTPPS(ONOO-的分解催化剂)等因素作用于SRA01/04细胞,以观察细胞核中p300蛋白含量、p300与NF-κB的硝基化水平、及硝基化对二者结合活性的影响,探讨高糖致人晶状体上皮细胞损伤的机制,为防治DC提供新思路。方法:1细胞培养及收集。SRA01/04细胞株用含10%胎牛血清、1%非必须氨基酸、低糖DMEM培养基,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。细胞传代后,将细胞种至培养皿内,至细胞覆盖皿底90%,加不同因素作用后,刮取,收集于EP管中,用以提取核蛋白。将细胞种于覆盖玻片的六孔板内,制细胞爬片,各因素作用后,多聚甲醛固定,用以检测细胞共定位及核转位。2分组及检测指标。2.1根据不同的因素和作用时间分为4组,以确定最佳浓度及时间。(1)不同浓度葡萄糖组(5,10,15,20,25,30mmol/L) (2)同浓度葡萄糖不同作用时间组(0,5,10,15,20,25,30,35,40min) (3)不同浓度SIN-1组(0,10,50,100,250,500μmol/L) (4)高糖+不同浓度FeTPPS组(0,5,10,25,50,100μmol/L)2.1.1 SRA01/04细胞分别经2.1作用因素作用后,细胞核蛋白用Lowry法检测蛋白含量,Western-blotting检测p300的蛋白含量及硝基化水平(NT含量);NF-κB p65不同糖浓度及作用时间的蛋白含量。2.1.2制作SRA01/04细胞爬片后,分别经2.1作用因素作用,用荧光显微镜检测NF-κB p65的核转位。2.2以作用因素最佳浓度及时间进行以下实验。(1)正常对照组(2)高糖组(25 mmol/L,25min) (3) SIN-1组(500μmol/L,25min) (4)高糖+ FeTPPS组(25 mmol/L+50μmol/L,25min)2.2.1 SRA01/04细胞经2.2作用因素作用后,用Lowry法定量核蛋白,检测p300与NF-κB p65的相互作用。2.2.2 Western-blotting检测免疫共沉淀的p300和NF-κB p65蛋白含量、硝基化水平(NT含量)及硝基化对p300与NF-κB p65相互作用的影响。2.2.3激光共聚焦显微镜检测p300与NF-κB p65的共定位。结果:1 SRA01/04细胞核蛋白中p300蛋白含量的Western blotting检测结果。1.1不同浓度葡萄糖组(5,10,15,20,25,30mmol/L)与正常糖浓度5 mmol/L比较,10mmol/L(P<0.05),15mmol/L(P<0.05),20mmol/L(P<0.01),25mmol/L(P<0.01),30mmol/L(P<0.01)各组p300蛋白含量均增高,差异有统计学意义。结果显示:随着葡萄糖浓度的升高,p300蛋白含量也随之升高,25mmol/L时升高最明显,30mmol/L时下降。1.2 25mmol/L葡萄糖不同作用时间组(0,5,10,15,20,25,30,35,40min)与25mmol/L糖浓度作用0min比较,5min(P<0.05),10min(P<0.05),15min(P<0.01),20min(P<0.01),25min(P<0.01),30min(P<0.01),35min(P<0.01),40min(P<0.01)各组p300蛋白含量均增高,差异有统计学意义。结果显示:随着时间的延长,p300蛋白含量随之增高,25min时升高最明显,30min时下降。1.3不同浓度SIN-1组(0,10,50,100,250,500μmol/L)与SIN-1浓度为0μmol/L即正常糖浓度5 mmol/L比较,SIN-1浓度10μmol/L(P<0.05),50μmol/L(P<0.01),100μmol/L(P<0.01),250μmol/L(P<0.01),500μmol/L(P<0.01)各组p300蛋白含量均增高,差异有统计学意义。结果显示:随SIN-1浓度的增加,p300蛋白含量随之升高,在500μmol/L时升高最明显。1.4 25mmol/L葡萄糖+不同浓度FeTPPS组(0,5,10,25,50,100μmol/L)与FeTPPS浓度为0μmol/L即25 mmol/L的糖浓度比较,FeTPPS浓度5μmol/L(P<0.05),10μmol/L(P<0.05),25μmol/L(P<0.05),50μmol/L(P<0.01),100μmol/L(P<0.01)各组p300蛋白含量均降低,差异有统计学意义。结果显示:FeTPPS浓度在5-25μmol/L时, p300蛋白含量降低。在50-100μmol/L时,p300蛋白含量降低明显。2 SRA01/04细胞核蛋白中p300硝基化水平变化的Western blotting检测结果。2.1不同浓度葡萄糖组作用25min(5,10,15,20,25,30mmol/L)与正常糖浓度5 mmol/L比较,10mmol/L(P>0.05),15mmol/L(P<0.05),20mmol/L(P<0.01),25mmol/L(P<0.01),30mmol/L(P<0.01)除10mmol/L外,各组p300蛋白硝基化水平均增高,差异有统计学意义。结果显示:随着葡萄糖浓度的升高,p300蛋白硝基化水平也随之升高,25mmol/L时升高最明显,30mmol/L时下降。2.2不同浓度SIN-1组(0,10,50,100,250,500μmol/L)与SIN-1浓度为0μmol/L即正常糖浓度5 mmol/L比较,SIN-1浓度10μmol/L(P<0.05),50μmol/L(P<0.01),100μmol/L(P<0.01),250μmol/L(P<0.01),500μmol/L(P<0.01)各组p300蛋白硝基化水平均增高,差异有统计学意义。结果显示:随着SIN-1浓度的升高,p300蛋白硝基化水平也随之升高,500μmol/L时升高最明显。2.3 25mmol/L葡萄糖+不同浓度FeTPPS组(0,5,10,25,50,100μmol/L)与FeTPPS浓度为0μmol/L即25 mmol/L的糖浓度比较,FeTPPS浓度5μmol/L(P<0.05),10μmol/L(P<0.01),25μmol/L(P<0.01),50μmol/L(P<0.01),100μmol/L(P<0.01)各组p300蛋白硝基化水平均降低,差异有统计学意义。结果显示:随着FeTPPS浓度的升高,p300蛋白硝基化水平随之降低,50-100μmol/L时,p300蛋白硝基化水平降低明显。3 SRA01/04细胞核蛋白中NF-κB p65蛋白含量的Western blotting检测结果。3.1不同浓度葡萄糖组(5,10,15,20,25,30mmol/L)与正常糖浓度5 mmol/L比较,10mmol/L(P<0.05),15mmol/L(P<0.01),20mmol/L(P<0.01),25mmol/L(P<0.01),30mmol/L(P<0.01)各组NF-κB p65蛋白含量均增高,差异有统计学意义。结果显示:随着葡萄糖浓度的升高,p65蛋白含量也随之升高, 25mmol/L时升高最明显,30mmol/L时下降。3.2 25mmol/L葡萄糖不同作用时间(0,5,10,15,20,25,30,35,40min)与25mmol/L糖浓度作用0min比较,5min(P<0.05),10min(P<0.01),15min(P<0.01),20min(P<0.01),25min(P<0.01),30min(P<0.01),35min(P<0.01),40min(P<0.01)各组NF-κB p65蛋白含量均增高,差异有统计学意义。结果显示:随着时间的延长,p65蛋白含量随之增高,20min时升高最明显,25min时下降。4 SRA01/04细胞中NF-κB p65的核转位。4.1 25mmol/L葡萄糖不同作用时间组(0,5,10,15,20,25,30,35,40min)与25mmol/L糖浓度作用0min比较,5min(P>0.05),10min(P<0.05),15min(P<0.01),20min(P<0.01),25min(P<0.01),30min(P<0.01),35min(P<0.01),40min(P<0.01)除了作用5min外,各组p65核转位比率均增高,差异有统计学意义。结果显示:随着时间的延长,p65核转位也随之增多,25-30min时升高最明显,35min时下降。4.2不同浓度SIN-1组(0,50,500μmol/L,25min)与未加SIN-1的5mmol/L正常糖浓度组比较,50μmol/L(P<0.01),500μmol/L(P<0.01)各组p65核转位比率均增高,差异有统计学意义。结果显示:随着SIN-1作用浓度的增加,p65核转位比率也随之增加。4.3 25mmol/L葡萄糖+不同浓度FeTPPS组(0,10,50μmol/L,25min)与未加FeTPPS的25mmol/L葡萄糖组比较,10μmol/L(P<0.01),50μmol/L(P<0.01)各组p65核转位比率均降低,差异有统计学意义。结果显示:随着FeTPPS作用浓度的增加,p65核转位比率也随之下降。5 SRA01/04细胞核蛋白中,p300与NF-κB p65的相互作用及硝基化水平。由核蛋白中p300蛋白含量及硝基化水平可确定各因素最佳作用浓度及作用时间。(1)正常组(5 mmol/L,25min) (2)高糖组(25 mmol/L,25min) (3)SIN-1组(500μmol/L,25min)(4)高糖+ FeTPPS组(25 mmol/L+50μmol/L,25min)5.1核蛋白中p300、NF-κB p65蛋白含量p300蛋白含量结果显示,与正常组相比,高糖组(P<0.01),SIN-1组(P<0.01)p300蛋白含量均增高,差异有统计学意义;高糖+ FeTPPS组(P>0.05)差异无统计学意义。与高糖组相比,SIN-1组(P>0.05)差异无统计学意义,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p300蛋白含量降低。与SIN-1组相比,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p300蛋白含量降低,差异有统计学意义。p65蛋白含量结果显示,与正常组相比,高糖组(P<0.01),SIN-1组(P<0.01)p65蛋白含量均增高,差异有统计学意义;高糖+ FeTPPS组(P>0.05)差异无统计学意义。与高糖组相比,SIN-1组(P>0.05)差异无统计学意义,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p65蛋白含量降低,差异有统计学意义。与SIN-1组相比,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p65蛋白含量降低,差异有统计学意义。表明高糖组、SIN-1组中p300与NF-κB p65蛋白含量均明显增加,高糖+ FeTPPS组中p300与NF-κB p65蛋白含量较高糖组和SIN-1组明显降低。5.2核蛋白中p300、NF-κB p65蛋白硝基化水平p300蛋白硝基化水平结果显示,与正常组相比,高糖组(P<0.01),SIN-1组(P<0.01)p300蛋白硝基化水平均增高,差异有统计学意义;高糖+ FeTPPS组(P>0.05)差异无统计学意义。与高糖组相比,SIN-1组(P>0.05)差异无统计学意义,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p300蛋白硝基化水平降低,差异有统计学意义。与SIN-1组相比,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p300蛋白硝基化水平降低,差异有统计学意义。p65蛋白硝基化水平结果显示,与正常组相比,高糖组(P<0.01),SIN-1组(P<0.01)p65蛋白硝基化水平均增高,差异有统计学意义;高糖+ FeTPPS组(P>0.05)差异无统计学意义。与高糖组相比,SIN-1组(P>0.05)差异无统计学意义,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p65蛋白硝基化水平降低,差异有统计学意义。与SIN-1组相比,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p65蛋白硝基化水平降低,差异有统计学意义。表明高糖组、SIN-1组中p300与NF-κB p65蛋白硝基化水平均明显增加,高糖+ FeTPPS组中p300与NF-κB p65蛋白硝基化水平较高糖组和SIN-1组明显降低。5.3硝基化对p300与NF-κB p65相互作用的影响。与p300蛋白相互作用的p65蛋白含量及硝基化水平结果显示,与正常组相比,高糖组(P<0.01),SIN-1组(P<0.01)p65蛋白含量及硝基化水平均增高,差异有统计学意义;高糖+ FeTPPS组(P>0.05)差异无统计学意义。与高糖组相比,SIN-1组(P>0.05)差异无统计学意义,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p65蛋白含量及硝基化水平均降低,差异有统计学意义。与SIN-1组相比,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p65蛋白含量及硝基化水平均降低,差异有统计学意义。与p65蛋白相互作用的p300蛋白含量及硝基化水平结果显示,与正常组相比,高糖组(P<0.01),SIN-1组(P<0.01)p300蛋白含量及硝基化水平均增高,差异有统计学意义;高糖+ FeTPPS组(P>0.05)差异无统计学意义。与高糖组相比,SIN-1组(P>0.05)差异无统计学意义,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p300蛋白含量及硝基化水平均降低,差异有统计学意义。与SIN-1组相比,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p300蛋白含量及硝基化水平均降低,差异有统计学意义。表明高糖组、SIN-1组中p300与NF-κB p65蛋白相互作用及硝基化水平均明显增加,高糖+ FeTPPS组中p300与NF-κB p65蛋白相互作用及硝基化水平较高糖组和SIN-1组明显降低。6 SRA01/04细胞中p300与NF-κB p65蛋白的共定位p300与NF-κB p65蛋白共定位的细胞数量,与5mmol/L正常糖浓度组比较,高糖组(P<0.01),SIN-1组(P<0.01)p300与NF-κB p65蛋白共定位的细胞数量增加,差异有统计学意义;高糖+ FeTPPS组(P>0.05)差异无统计学意义。与高糖组相比,SIN-1组(P>0.05)差异无统计学意义,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p300与NF-κB p65蛋白共定位的细胞数量降低,差异有统计学意义。与SIN-1组相比,高糖+ FeTPPS组(P<0.01)p300与NF-κB p65蛋白共定位的细胞数量降低,差异有统计学意义。表明高糖组、SIN-1组中p300与NF-κB p65蛋白共定位的细胞数量均明显增加,高糖+ FeTPPS组中p300与NF-κB p65蛋白共定位的细胞数量较高糖组和SIN-1组明显降低。结论:1高糖刺激人晶状体上皮细胞(SRA01/04),p300在核内聚集,含量增加。2高糖刺激人晶状体上皮细胞(SRA01/04),可使p300和NF-κB蛋白硝基化。3硝基化可增强p300与NF-κB的相互作用,抑制p300与NF-κB的硝基化可在防治DC中起关键作用。