论文部分内容阅读
背景:酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）是由于长期过量饮酒导致的肝细胞结构异常以及（或者）功能障碍性疾病。炎症在酒精性肝病的发病过程中起到尤为重要的作用。腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）作为一种重要的信号转换器,不仅在细胞的能量代谢中起着重要的作用,而且在包括ALD在内的慢性肝病的病理生理过程中也成为一种“危险信号”。在细胞外腔室中,ATP主要通过激活嘌呤能受体来发挥信号分子的作用。Irachetavellve等发现,在ALD中除了释放细胞因子/炎症因子外,还会产生大量ATP。P2Y2受体（P2Y2R）是P2Y受体家族的一个亚型,具有独特的结构和功能,由配体UTP激活,触发Ca2+内流,介导一系列细胞信号转导途径,并已被发现在多种疾病中都起到重要作用。细胞外ATP主要在CD39的作用下水解为ADP和AMP,而AMP主要由CD73转化为腺苷,并且ATP可以通过激活P2嘌呤受体在多种疾病中发挥重要作用。最近的研究表明胞外酶CD39/ENTPD1可以减轻由于脓毒症所引起的肝脏受损。因此,我们研究了ATP-P2Y2R和CD39是否可以作为治疗靶点,以及CD39和P2Y2R在酒精相关性脂肪性肝炎中的相互调节作用。目的:（1）探究ATP-P2Y2R和CD39在酒精相关性脂肪性肝炎中起到的作用;（2）探究ATP-P2Y2R与CD39之间的相互调控作用;方法:体内采用6-8周的雄性C57BL/6小鼠（18-22g）通过连续酒精喂养加急性酒精灌胃的方法进行酒精性脂肪肝炎模型的建立。将小鼠随机分为空白对照组（Pair-fed,n=8）,酒精组（Et OH-fed,n=16）,P2Y2受体抑制剂苏拉明（Suramin）的低剂量（Suramin-L,5 mg/kg,n=16）、中剂量（Suramin-M,10 mg/kg,n=16）和高剂量组（Suramin-H,20 mg/kg,n=16）。首先用含5%乙醇的Lieber-De Carli酒精液体饲料喂养10天,于第4天开始每天一次对抑制剂组小鼠进行腹腔注射Suramin,连续注射7天,其余组给予相同体积的0.9%Na Cl。第11天清晨酒精灌胃一次,禁食9h后进行处理。体外采用100m M乙醇刺激RAW264.7细胞24h进行酒精相关性脂肪性肝炎模型的建立,细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM中,并置于37°C,含5%CO2的培养箱中。加药组首先以100m M乙醇刺激12h进行造模,在造模的基础上分别加入外源性ATP（e ATP）,尿苷三磷酸（uridinetriposphate,UTP）,Suramin继续培养约24h。转染组RAW264.7细胞在指定的孔中培养12h,使用Lipofectamine TM2000转染Si RNA6h后,将Opti-MEM改为DMEM（含10%BI）,加入100m M乙醇,持续培养36h。体内采用酶标仪比色法检查血清学指标ALT,AST,TC和TG;HE染色法观察肝脏损伤情况;油红O染色法观察肝脏里脂质堆积情况;体外采用MTT检测细胞活力;体内外均采用Western blot和（或）RT-q PCR和（或）ELISA检测CD39,P2Y2R,IL-6,IL-1β和TNF-ɑ的表达;ATP检测试剂盒检测ATP含量。结果:体内实验中,与对照组相比,酒精饲养组血清学指标ALT,AST,TC和TG表达均增高,肝脏中肝索排列紊乱并且有大量脂肪空泡产生,脂质堆积明显,ATP含量增高;CD39,P2Y2R和促炎因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）的表达均被上调。而与酒精饲养组相比,P2Y2R抑制剂组以剂量依赖的方式明显改善了上述肝脏损伤,其中以高剂量组的效果最为明显,与此同时,有趣的是CD39的表达也随着P2Y2R表达的降低而降低。体外实验中,与对照组相比,乙醇组CD39、ATP、P2Y2R以及促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的表达均升高。与乙醇组相比,加入外源性ATP导致P2Y2R,IL-6,IL-1β和TNF-α表达随之升高,P2Y2R抑制剂Suramin组和P2Y2R-Si RNA组下调CD39的表达同时下调促炎因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）表达,P2Y2R激动剂UTP组结果则与之相反,这与之前体内实验结果一致。CD39-Si RNA组,ATP、P2Y2R、IL-6、IL-1β和TNF-α的表达随CD39的降低反而都增高。结论:（1）ATP可以通过激活P2Y2R促进酒精相关性脂肪性肝炎的发生;（2）抑制P2Y2受体可以减轻酒精相关性脂肪性肝炎;（3）抑制CD39会加重酒精相关性脂肪性肝炎;（4）抑制P2Y2R表达可以直接降低CD39的表达,而抑制CD39可以通过增高ATP含量间接的使P2Y2R表达上调。