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天然免疫又被称之为非特异性免疫,指个体与生具有的、作用范围广、不针对特定抗原的免疫能力。天然免疫是一种包含大量模式识别受体(PRR)的高度复杂的快速诱导免疫反应,这些模式识别受体识别各种病原体相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Patterns,PAMPs),并通过各个不同的信号通路激活机体的免疫应答。IKKε(inhibitor of NF-kB kinase ε)是天然免疫系统中Toll-Like信号通路以及NF-kB (nuclear factor-kappa B)信号通路中的一种激酶,它是最新发现的IκB激酶家族(IkB kinase,IKKs)的成员,最初被认定为脂多糖诱导的丝氨酸/苏氨酸激酶。IKKε在信号分子的作用下磷酸化IkBα来诱导激活NF-kB,或者与TBK1(TANK-binding kinase1)在支架蛋白的作用下磷酸化IRF3(interferon regulatory factor3)与IRF7(interferon regulatory factor7)激酶,从而诱导IFN的分泌。天然免疫是鱼类等低等脊椎动物的防御病害侵袭的基础,存在于哺乳动物中的天然免疫信号通路的许多基因组分在硬骨鱼中也是保守的。目前,鱼类TLRRIG-I,以及MAVS基因都已经成为当今鱼类天然免疫的研究热点,然而有关鱼类IKKε在天然免疫中的功能研究却罕见报道。在本论文中,我们克隆了鲤科重要经济养殖鱼类——草鱼、青鱼的IKKε基因cDNA全长序列,以及二倍体/三倍体/四倍体特殊性鱼类的IKKs基因部分cDNA基因序列,并初步研究了青鱼IKKε基因的功能。本论文的研究内容及结果如下：1.青鱼IKKε基因cDNA全长2537bp,其中5’非编码区长度为285bp,开放阅读框的长度为2169bp,3’非编码区的长度为83bp,预测可编码723个氨基酸,蛋白分子量为82556。草鱼IKKε基因的cDNA全长2529,其中5’非编码区长度为274bp,开放阅读框的长度为2169bp,3’非编码区的长度为86bp,预测可编码723个氨基酸,蛋白分子量为82476.9。2.比较青鱼与草鱼的IKKs基因的同源性得知：青鱼草鱼的IKKε基因同源性非常高,达到了97.3%；与斑马鱼IKKε基因的序列同源性为73.4%；与哺乳动物和鸟类的IKKε基因同源性较低。通过进化树分析也可以发现,青鱼与草鱼的IKKε基因出现在同一个分支,符合它们同源性很高的比对结果。对青鱼与草鱼的IKKε的氨基酸序列分析发现,两者的蛋白质序列都具有IκB激酶家族相似的蛋白结构域。3.以pcDNA5-FRT/TO载体和CDH-CMV-Linker载体为基础构建了表达青鱼的IKKε基因的重组质粒,pcDNA5-FRT/TO-FLAG-BC·ikk与pcDNA5-FRT/TO-BC-ikk-FLAG以及CDH-CMV-Puro-FLAG-BC-ikk与CDH-CMV-Puro-BC-ikk-FLAG载体。通过磷酸钙转染法将该重组质粒转染到HEK293T细胞中,Westen blot检测到青鱼的IKKε基因能够在HEK293T细胞中正常表达,并证实了其蛋白分子量大约为85KD左右。4.使用Lipofectamine2000将FRT/TO-Flag-bcIKKε及FRT/TO-bcIKKε-Flag重组质粒分别转染到小鼠成纤维细胞NIH3T3以及鲤科鱼类成纤维细胞EPC细胞中,通过免疫荧光和激光共聚焦扫描分析结果表明青鱼IKKε基因主要在细胞质中表达。5.克隆了二/三倍体IKKε基因部分编码区,以及四倍体IKKε基因部分cDNA序列。其中四倍体IKKε基因3’非编码区长度为85bp。综上所述,本实验克隆了草鱼、青鱼的IKKε基因cDNA全长序列,并克隆了二／三／四倍体IKKε基因cDNA的部分序列。并对青鱼IKKε基因的表达和细胞内定位做了初步研究。本论文对将来系统研究IKKe基因在青鱼、草鱼以及多倍体鱼天然免疫中的功能打下了基础。