缺血性脑血管病具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点,造成了严重的社会问题和经济负担。因此,深入认识其发病机制,寻找新的治疗靶点是目前亟待解决的问题。缺血性脑血管病的直接原因是脑血流减少,导致氧和能量供应中断,细胞死亡。治疗后脑血流恢复,但往往出现神经系统损伤加重的情况,即缺血再灌注损伤。中医理论认为中风病（这里主要指缺血性脑血管病）的病因与风、火、痰、瘀等毒邪损伤脑络有关。传统中药丹参具有活血化瘀的功效,已广泛应用于缺血性脑血管病的临床治疗。丹酚酸B（Salvianolic acid B）是从传统中药丹参中提取的水溶性有效成分,由3分子丹参素和1分子咖啡酸缩合而成的酚酸类化合物,具有很强的抗氧化、清除自由基作用,但其在脑缺血再灌注损伤过程中的作用机制还不完全清楚。本论文以中医中风病理论为指导,在我们实验室已证明丹酚酸B对小鼠脑缺血性损伤具有治疗作用的基础上,采用原代培养大鼠皮层神经细胞,建立缺糖缺氧/复糖复氧的细胞模型,从兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、细胞凋亡的角度研究神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用的机制。论文的实验研究包括四个部分:一、缺糖缺氧模型的建立及丹酚酸B有效剂量的确定目的:建立稳定可靠的缺糖缺氧模型,并确定丹酚酸B的有效剂量。方法:体外培养大鼠大脑皮层神经细胞,复制神经细胞缺糖缺氧2h、3h、4h、5h的细胞模型,测氧仪测量培养液中溶解氧浓度,采用MTT法检测细胞活性和存活率。结果:体外培养的神经细胞状态稳定,经免疫组化神经元特异性烯醇化酶（NSE）鉴定阳性细胞比例达70～80%,神经细胞Nissl’s染色显示Nissl’s小体丰富。随缺糖缺氧时间延长,培养液中溶解氧浓度逐渐降低,神经细胞活性、存活率也随之下降,各时间点与正常组比较均有显著性差异（P＜0.01）。选择对细胞损伤较重的缺糖缺氧4 h作为模型时间。神经细胞缺氧缺糖4 h后活性明显下降,与正常组比较有显著性差异（P＜0.01）。丹酚酸B治疗组包括10μg/L,100μg/L,1mg/L,5 mg/L,7.5 mg/L,10 mg/L,25 mg/L和50 mg/L共8个不同剂量,其中10、25、50 mg/L 3个剂量的丹酚酸B明显增强神经细胞活性,且存在量效关系,与缺糖缺氧4 h组相比差异明显（P＜0.01）。将10、25、50 mg/L3个剂量的丹酚酸B加入正常神经细胞,其活性与正常组之间没有显著性差异。选择终浓度10 mg/L作为以下实验丹酚酸B的用药剂量。二、缺糖缺氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究目的:探讨缺糖缺氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用的机制。方法:将培养的神经细胞随机分为正常组、缺糖缺氧4 h组和丹酚酸B治疗组。复制缺糖缺氧4 h的病理模型,MTT法观察神经细胞活性和存活率,比色法检测LDH漏出率和培养液中谷氨酸含量,流式细胞术测定神经细胞线粒体膜电位（MMP）、胞浆内Ca²⁺,倒置相差显微镜、HE染色及透射电镜观察神经细胞形态和超微结构的变化。结果:神经细胞缺糖缺氧4 h后活性、存活率、MMP荧光值明显降低,LDH漏出率、培养液中谷氨酸含量及胞浆内Ca²⁺荧光强度显著升高,与正常组比较有显著性差异（P＜0.01）。丹酚酸B治疗组神经细胞活性、存活率、MMP荧光值均增高,LDH漏出率、培养液中谷氨酸含量、胞浆内Ca²⁺荧光强度下降,与缺糖缺氧4 h组比较有显著性差异（P＜0.05～0.01）。正常组神经细胞胞体呈锥体形,细胞器丰富:缺糖缺氧4 h组大部分神经细胞肿胀,细胞器数目有所减少,可见线粒体肿胀明显;丹酚酸B治疗组神经细胞轻度肿胀,细胞器结构尚完整。三、复糖复氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究目的:研究复糖复氧对神经细胞的氧化损伤,并在体外模型中证实丹酚酸B的干预作用与其抗氧化能力有关。方法:神经细胞随机分为正常组、复糖复氧组和丹酚酸B治疗组。MTT法检测缺糖缺氧3h/复糖复氧1h、3h、6h、12h、18h、24h共6个时间点神经细胞活性、存活率。缺糖缺氧3h/复糖复氧3h、24h分别代表再灌注早期、晚期,并采用比色法观察神经细胞LDH漏出率,荧光标记和自旋捕集技术检测细胞内ROS水平,比色法测定神经细胞内Mn-SOD、CAT和GSH-PX的活性。倒置相差显微镜观察神经细胞形态变化。结果:缺糖缺氧3h后复糖复氧1h、3h、6h、12h、18h、24h,神经细胞活性、存活率均较正常组降低（P＜0.05～0.01）;除复糖复氧1h、12h外,其他时间点丹酚酸B治疗组神经细胞活性、存活率均高于复糖复氧组（P＜0.05）。神经细胞复糖复氧3h、24h后,LDH漏出率、细胞内ROS均明显高于正常组（P＜0.05～0.01）;而丹酚酸B治疗组神经细胞LDH漏出率、细胞内ROS则低于复糖复氧组（P＜0.05～0.01）。复糖复氧3h、24h神经细胞内Mn-SOD、CAT、GSH-PX的活性均降低,与正常组比较差异明显（P＜0.05～0.01）,丹酚酸B治疗组神经细胞内抗氧化酶的活性明显高于复糖复氧3h、24h组（P＜0.05～0.01）。正常组神经细胞胞体饱满,突起粗大伸展;复糖复氧3h后神经细胞形态发生改变,至24h神经细胞皱缩,部分细胞死亡;丹酚酸B治疗组神经细胞形态变化有所减轻。四、复糖复氧诱导神经细胞凋亡及丹酚酸B抗凋亡作用机制的研究目的:探讨复糖复氧诱导神经细胞凋亡及丹酚酸B抗凋亡作用的机制。方法:神经细胞随机分为正常组、复糖复氧24h组和丹酚酸B治疗组。复制缺糖缺氧3h/复糖复氧24h的细胞模型。激光扫描共聚焦显微镜测定胞浆内Ca²⁺荧光强度,流式细胞仪检测MMP、细胞凋亡率,免疫组化法观察细胞内Bcl-2、Bax的表达水平,Western blot测定细胞色素C释放率,Hoechst 33342染色观察细胞核形态变化,透射电镜观察神经细胞超微结构。结果:缺糖缺氧3h/复糖复氧24h引起胞浆内Ca²⁺荧光强度明显增高,MMP荧光值降低,神经细胞凋亡率明显增高,与正常组相比有显著性差异（P＜0.01）。丹酚酸B治疗组胞浆内Ca²⁺荧光强度降低,MMP荧光值增强,凋亡率下降,与复糖复氧24h组相比亦有显著性差异（P＜0.01）。神经细胞复糖复氧24h,Bcl-2表达减弱,Bax表达升高,与正常组相比有显著性差异（P＜0.01）。丹酚酸B治疗组Bcl-2表达增加,Bax表达降低,与复糖复氧24h组比较差异明显（P＜0.05）。正常组胞浆内细胞色素C含量很低,主要集中于线粒体,复糖复氧24 h后胞浆内细胞色素C含量明显升高,其灰度值与正常组相比有显著性差异（P＜0.01）,丹酚酸B治疗组胞浆内细胞色素C含量低于复糖复氧24 h组（P＜0.05）。复糖复氧24 h组细胞色素C释放率明显高于正常组（P＜0.01）,丹酚酸B治疗组细胞色素C释放率明显降低,两组相比差异明显（P＜0.05）。正常神经细胞经Hoechst33342荧光染色,核呈均匀的蓝色荧光;复糖复氧24 h组则有较多细胞核呈凝聚固缩,荧光明显增强,并有核碎裂;丹酚酸B治疗组细胞核大部分呈淡蓝色或蓝色荧光,接近正常组,仅见个别细胞核浓染呈明亮蓝色荧光。透射电镜观察复糖复氧24 h组神经细胞核染色质凝聚,细胞膜完整,符合凋亡的形态改变;丹酚酸B治疗组神经细胞超微结构变化较复糖复氧24 h组有所减轻。结论:本研究建立了稳定可靠的神经细胞原代培养体系,复制的细胞模型可以实现体外神经细胞缺糖缺氧损伤。缺糖缺氧4 h引起神经细胞培养液中谷氨酸含量增加、细胞内Ca²⁺超载、MMP下降。丹酚酸B通过减少培养液中的谷氨酸含量,抑制神经细胞内Ca²⁺超载,稳定MMP,从而对缺糖缺氧神经细胞起到保护作用。缺糖缺氧3 h/复糖复氧3 h、24 h对神经细胞的损伤与氧化应激有关,丹酚酸B可以清除细胞内ROS,提高抗氧化酶Mn-SOD、CAT、GSH-PX的活性,从而对复糖复氧神经细胞起到保护作用。缺糖缺氧3h/复糖复氧24 h可诱导神经细胞发生凋亡,丹酚酸B通过保护线粒体功能,提高Bcl-2的表达,降低Bax的表达,减少促凋亡物质的释放,起到抗凋亡作用。综上所述,神经细胞缺糖缺氧损伤的机制与兴奋性毒性、细胞内Ca²⁺超载有关,而复糖复氧损伤的机制则涉及到氧化应激、线粒体途径的细胞凋亡。丹酚酸B通过减轻兴奋性毒作用,抑制神经细胞内Ca²⁺超载保护缺糖缺氧的神经细胞,通过改善细胞的氧化-还原状态,保护线粒体功能,拮抗凋亡,对复糖复氧神经细胞起到保护作用。