不孕症是妇科常见病之一,其中,女性因素占40-55%,在引起女性不孕的众多原因中9.2%为宫腔粘连导致。宫腔粘连的发生主要与宫腔手术创伤和宫腔感染有关,是宫腔手术后的远期主要并发症。患者大多有过多次人工流产史,尤其是人工流产术中过度刮宫,或术后继发宫腔感染,破坏了子宫内膜,严重时即可形成宫腔粘连,导致闭经和继发不孕。宫腔镜手术分离配合雌孕激素人工周期治疗是目前主要的治疗方案。但治疗效果并不太满意,子宫内膜的发育并不能很好的改善。子宫内膜是一个高度再生组织,在整个妇女的生育期要经历生长、分化和脱落400多次的循环。研究显示子宫内膜中含有子宫内膜干细胞。并将其定位于子宫内膜和子宫肌层交界部位。子宫内膜干细胞作为一种成体干细胞,已被证实具有高增殖潜力和多向分化的功能。子宫内膜干细胞在子宫内膜周期性增生和脱落中起到了关键作用。鉴于子宫内膜干细胞与子宫内膜生长的密切关系。我们从体外分离培养子宫内膜干细胞,然后移植到子宫内膜治疗子宫内膜发育不良性疾病,可能为因子宫内膜原因而导致的不孕症提供一种新的治疗方法。本实验主要探讨从切除的子宫中分离、培养子宫内膜干细胞,并对常用的三种细胞分离方法进行比较,旨在找出一种简便、实用、高效的体外分离、培养子宫内膜干细胞的方法,为进一步的研究提供基础的参考数据。目的1.探索从切除的子宫中分离培养子宫内膜干细胞。2.通过对三种不同分离方法的比较,从中优选出一种简便、实用、高效的体外分离、培养人子宫内膜干细胞的方法。材料与方法1材料选取2010年3月～2010年6月在郑州大学第三附属医院妇科因子宫肌瘤、子宫脱垂、原位宫颈癌等而进行子宫切除手术的住院治疗的患者,年龄在31～49岁。要求术前3个月未使用过任何激素。详细记录病人的信息,如年龄,手术切除子宫的原因等。2方法2.1标本的处理子宫全切术后,无菌剃取子宫内膜组织并包括5 mm的子宫肌层。将收集的子宫内膜标本放入无菌的青、链霉素溶液中,2h内送入实验室。用无Ca2+Mg2+的缓冲液(PBS)进行冲洗,直到液体清亮。移入无菌的培养皿中,用眼科剪剪至1 mm3大小,呈糊状。2.2组织分离和培养采用三种不同的分离方法：胰蛋白酶法、胶原酶Ⅰ法和混合法(胰蛋白酶法+胶原酶Ⅰ法)进行细胞分离和提取,并对三种不同的分离方法进行比较。将分离的细胞悬液用台盼兰染色,计数活细胞。按照2×105个/ml的细胞密度分别接种于25 cm2的培养瓶中,DMEM/F12培养液中包含10%胎牛血清,青、链霉素溶液,37℃,5%CO2培养箱孵育48 h后换液一次。弃去未贴壁细胞,以后每2～3天换液一次,并观察细胞生长情况。每种方法实验重复10次,取第2代生长到第5天的细胞,用台盼兰染色,倒置显微镜下计数活细胞数,每高倍镜下计数三次,取其平均数。以比较那种分离方法得到的活细胞数量多。2.3细胞的鉴定方法用造血干细胞标志物CD90和间质干细胞标志物CD146单克隆抗体,采用免疫细胞化学法和RT-PCR法,对培养的子宫内膜干细胞进行鉴定。2.4绘制细胞生长曲线图取对数生长期的细胞,接种于24孔板中,置培养箱培养；每24 h计数一次,每次计三孔,取其平均数；连续计数7天,将所得资料以天数为横坐标,细胞数为纵坐标绘制曲线,绘制细胞生长曲线。2.5统计分析实验所得数据用SPSS16.0软件包进行统计学分析,各组数值变量参数以均数±标准差(x±s)表示,组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用LSD(least significant differerence)检验,方差分析前对各组数据进行正态性检验(Shapiro-Wilk Test)和方差齐性检验(Levene’s Test),以a=0.05为检验水准。结果1.子宫内膜干细胞形态观察培养的子宫内膜干细胞形态呈梭形,具有成纤维细胞形态,细胞贴壁平铺生长,细胞排列无极性。2.子宫内膜干细胞的鉴定经干细胞标志物CD90和CD146单抗免疫细胞化学染色为阳性；经RT-PCR鉴定子宫内膜干细胞CD90和CD146的DNA分别在150bp和500bp高表达,而对照组不表达。证明培养的细胞具有干细胞特性。3.三种分离方法培养的子宫内膜干细胞生长周期的比较所得单细胞悬液经培养后,第2代细胞经细胞计数法所得生长曲线图比较,无明显差异(F=0.291,P>0.05)。均为近似“S”形,具有相同的细胞生长周期。4.三种分离方法的比较对三组间年龄比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。三种分离方法获得的活细胞比较,胶原酶Ⅰ法获得的活细胞数(0.721±0.004)明显多于胰蛋白酶法(0.672±0.002)和混合法获得的的细胞数(0.671+0.001),差异有统计学意义(F=103.882,P<0.01)。结论1.从切除的子宫中成功获得子宫内膜干细胞。2.胶原酶Ⅰ法分离子宫内膜干细胞是一种实用、高效、稳定的体外子宫内膜干细胞分离培养方法。