目的:口腔结合上皮(junctional epithelium, JE)是附着在牙颈部连接结缔组织与牙面的特殊上皮结构,形成龈-牙结合部。结合上皮来自于缩余釉上皮,是一种无角化无钉突的上皮组织,也是口腔生理上的一个薄弱环节。在牙周炎发生时,结合上皮首先被破坏,是牙周炎的始发部位。由于结合上皮的摧毁,导致牙周袋形成和牙槽骨吸收,牙周炎进入进展期和活动期,成为严重破坏口腔咀嚼功能的疾病。当牙周炎静止后,结合上皮所构成的龈-牙结合修复缓慢,正常牙周结构重建困难。因此,研究结合上皮的再生和诱导是研究牙周炎治疗后牙周功能结构重建的难点和重点。本研究拟通过对人牙周成纤维细胞的体外培养,诱导形成结合上皮样细胞,生长在脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix, ADM)支架和小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)支架组织上,探讨诱导形成的结合上皮样细胞及其形成的组织结构,为龈-牙结合部的形成提供上皮细胞来源的理论依据和实验室数据。牙周膜又称牙周韧带(Periodontal ligament),是牙根与牙槽骨之间的一层结缔组织,是重要的牙周支持组织,主要由成纤维细胞组成。许多研究已证明牙周成纤维细胞具有干细胞的特性[1~4]。正常情况下,牙周组织具有极强的修复能力,其修复活动是通过牙周膜中的不同细胞亚群的定向迁移和分化实现的[5、6]。本实验拟采用牙周成纤维细胞,诱导成为上皮样细胞,揭示牙周成纤维细胞具备多向分化的干细胞特征。随着组织工程技术的发展,选择适合的支架材料是组织工程研究的又一重要内容。目前,常用的支架材料有猪小肠粘膜下层支架、引导组织再生胶原膜、脱细胞真皮基质,纳米羟基磷灰石等。这些材料多具有良好的生物相容性、多孔性结构和高孔隙率及生物可降解性[7]。本实验选用脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix, ADM)和小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)两种支架材料作为结合上皮样细胞附着的支架组织,探讨结合上皮样细胞对支架组织的附着能力及相容性,并探讨结合上皮样细胞在支架组织上生长的免疫特性和超微结构。方法:1人牙周成纤维细胞的培养和鉴定收集河北医大口腔医院正畸拔除的健康完整双尖牙(患者12~30岁),刮下其根中1/3牙周膜组织。采用组织块培养法,培养液选用含20%胎牛血清的低糖DMEM,0.25%胰酶消化,传代至第3代,采用抗波形蛋白vimentin和抗细胞角蛋白CK的免疫细胞化学进行细胞鉴定。2人牙周成纤维细胞的诱导培养采用K-SFM培养液,对第3代人牙周成细胞进行诱导培养7~10天,采用抗波形蛋白vimentin和抗细胞角蛋白CK的免疫细胞化学进行细胞鉴定。3小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)支架组织的制备留取猪空肠组织50 cm,去除其浆膜层和肌层,在含有双抗(青霉素、链霉素)的PBS溶液中浸泡3 h;0.25 %胰酶中浸泡24 h;双蒸水漂洗,0.5% SDS 24 h;双蒸水漂洗。在含0.1 %过氧乙酸的20 %乙醇溶液中浸泡10 h,双蒸水漂洗;冻干后环氧乙烷消毒备用。4人牙周成纤维细胞接种及诱导培养将人牙周成纤维细胞分别接种到小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)和脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix, ADM)上,K-SFM诱导培养3~5天。石蜡包埋,组织切片角蛋白CK免疫组织化学染色。扫描电镜观察细胞在支架上的生长状态。结果:1原代培养及其鉴定牙周组织原代培养7~10天,细胞爬出,获得的成纤维细胞呈梭形、胞体大,核大,圆形或椭圆形,有1~3个核仁。采用第3代细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,成纤维细胞对抗波形蛋白vimentin呈阳性反应,抗角蛋白CK阴性反应。2人牙周成纤维细胞诱导及鉴定经K-SFM诱导后细胞爬片,免疫细胞化学染色,抗角蛋白CK阳性表达,表明牙周成纤维细胞诱导培养后,具备上皮细胞的免疫特性。3小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)支架组织的电镜观察制备所得SIS经扫描电镜观察为无细胞的胶原束。4人牙周成纤维细胞接种及诱导培养牙周成纤维细胞在支架组织上诱导培养后,石蜡包埋切片,免疫组织化学染色,抗角蛋白CK阳性表达。扫描电镜观察发现,细胞在支架上生长良好,成片生长,细胞多边形,扁平样,核圆形或椭圆,核仁1~2个。形成结合上皮样细胞结构。结论:1牙周成纤维细胞能诱导分化为结合上皮样细胞。2结合上皮样细胞在支架组织上生长,形成结合上皮样组织。