论文部分内容阅读
Coiled coil是蛋白质组中广泛存在的一类介导蛋白质相互作用的自主折叠的结构域，酵母膜泡运输系统的蛋白质明显富含此类结构域。尽管有些由coiled coil介导的蛋白质相互作用在膜泡运输过程中发挥着重要作用，但这些coiled coil蛋白质之间完整的相互作用图谱尚不具备。我们实验室提出了计算/实验相结合的筛选策略来系统地构建酵母膜泡运输中coiled coil结构域相互作用网络。本论文在计算预测工作的基础上，利用酵母双杂交检测了潜在的coiled coil相互作用，建立囊泡运输中由coiled-coil介导的包含58对蛋白质相互作用的网络，其中涉及80对coiled coil相互作用。该网络遍及膜泡运输过程的多种组织和调控环节，并在一定程度上提供了Q-SNAREs和R-SNAREs识别的专一性。在这58对coiledcoil介导的蛋白质相互作用中21对是新鉴定出的蛋白质物理相互作用。我们构建了基于酵母质粒表达体系的双分子荧光互补(BiFC)系统，经过测试后将其用于检测这21对新发现的蛋白质相互作用，结果发现其中6对coiled coil相互作用能被BiFC方法检测到。深入分析酵母MVB途径重要蛋白复合体ESCRT-Ⅲ中coiled coil相互作用的特点，发现该复合体成员间密集地通过coiled coil发生相互作用，这可能对该复合体的组装及其在内吞体膜上网格状结构的形成有贡献。酵母双杂交和GST pull-down结果共同显示通过检测coiled coil相互作用发现的ESCRT-Ⅲ成员SNF7和VPS60之间的相互作用在它们的全长蛋白质水平仍旧能够发生。所有上述结果都说明coiled coil相互作用及其特异性在膜泡运输过程的组织和调控中有特殊作用。