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目的:内皮细胞相互连接形成完整的血管内壁,是维持血循环稳定的重要基础,通过复杂的机制,在维持凝血系统与纤维蛋白溶解（纤溶）系统平衡方面发挥重要的作用。组织纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activators,t-PA）激活纤维蛋白溶解酶原（plasminogen,PLG）生成纤维蛋白溶解酶（plasmin,PL）,是启动纤溶系统的关键步骤。内皮细胞表面表达annexin A2（ANXA2）,作为t-PA和PLG的细胞表面受体,为t-PA激活PLG的反应提供重要的细胞表面位点,显著提高纤溶的效率。越来越多的证据显示cAMP信号转导通路参与调控内皮细胞ANXA2。基于既有的研究结果,结合cAMP-Epac信号转导通路特异抑制剂ESI09,本研究旨在探讨内皮细胞内直接由cAMP激活的鸟苷酸交换蛋白Epac1在纤溶系统中的调控作用。方法:1、研究Epac1基因敲除对小鼠纤溶功能的影响免疫组织化学染色法（IHC）:对比Epac1基因敲除和野生型小鼠的肺、肾、脑组织,观察组织微血管内是否有异常的纤维蛋白沉积。建立氯化铁（FeCl3）诱导的小鼠血栓模型:应用FeCl3造成小鼠颈动脉损伤后,监测血流速度变化,观察Epac1基因敲除小鼠和野生型小鼠颈动脉受损后血流受阻程度及恢复情况,间接反映清除血栓的能力,从而反映敲除Epac1基因对小鼠纤溶系统功能的影响。2、研究Epac1基因敲除小鼠血浆ANXA2含量变化酶联免疫吸附法（ELISA）定量测定Epac1基因敲除小鼠和野生型小鼠血浆ANXA2含量。3、研究Epac1是否通过改变循环血ANXA2的含量影响小鼠的纤溶功能ANXA2补充实验:利用已建立的FeCl3诱导的小鼠血栓模型,通过尾静脉注射重组ANXA2,以血流速为指标,观察Epac1基因敲除小鼠和野生型小鼠颈动脉受损后血流受阻程度及恢复情况。4、研究功能性抑制内皮细胞Epac1对细胞膜表面ANXA2表达量的影响人脐静脉内皮细胞（HUVECs）预处理:用Epac特异抑制剂（ESI09）预处理HUVECs作为实验组,用二甲基亚砜（DMSO）处理的HUVECs作为对照组。细胞表面免疫荧光法（IF）:免疫荧光染色标记细胞表面ANXA2,比较不同预处理组细胞表面免疫荧光的强弱,并通过Image J半定量测定细胞表面ANXA2的相对荧光强度,反映细胞表面ANXA2的表达量。原子力显微镜法（AFM）:以ANXA抗体预处理探针,通过模拟抗体-抗原的相互作用,测定抗体与细胞表面相应蛋白抗原之间的作用力,通过比较单位面积内作用力的大小,间接反映细胞表面蛋白的表达量的多少。5、探讨Epac1调控细胞膜表面ANXA2表达的机制免疫沉淀法（IP）:差速离心法去除细胞核部分,用S100A10抗体富集细胞剩余部分（post nuclear fraction,PNF）的S100A10及相关蛋白。蛋白免疫印迹法（WB）:行WB检测内皮细胞经ESI09预处理后,S100A10相关ANXA2的蛋白含量是否有变化。结果:1、Epac1基因敲除小鼠的纤溶功能减弱免疫组化染色分析Epac1基因敲除小鼠的肺、肾、脑的微血管,对比野生型小鼠相应器官的类似部位,Epac1基因敲除小鼠的微血管内有明显增多的纤维蛋白沉积。根据血流探测探头测得血流速变化显示,Epac1基因敲除小鼠的颈动脉应用FeCl3溶液造成血管损伤后,Epac1基因敲除小鼠的颈动脉血流受阻程度高,且血流恢复率较低,与对照组比较结果有差异。2、Epac1基因敲除小鼠血浆ANXA2含量下降酶联免疫吸附法定量检测小鼠血浆内ANXA2的表达含量,结果显示,相比野生型小鼠血浆,Epac1基因敲除导致小鼠血浆内ANXA2含量减少,且差异结果有意义。3、Epac1基因敲除小鼠减弱的纤溶功能可经补充ANXA2而改善已建立的FeCl3诱导的小鼠颈动脉血栓模型结果显示,相比对照组,Epac1基因敲除小鼠的颈动脉受损后,血流受阻程度高,血流恢复机率低,在通过小鼠尾静脉补充重组ANXA2后,相比较未经重组ANXA2处理的Epac1基因敲除小鼠实验结果,血管受损后,经重组ANXA2处理的Epac1基因敲除小鼠的血流受阻程度降低,血流恢复机率增加。4、药物性抑制内皮细胞Epac1功能使细胞表面ANXA2的表达量降低HUVECs经ESI09预处理后,行非渗透性免疫荧光标记细胞表面ANXA2,通过Image J定量测定免疫荧光相对强度,结果显示,与对照组相比,细胞内Epac1功能受ESI09抑制后,HUVECs细胞表面ANXA2表达量下降,且差异结果有意义。原子力显微镜测定ANXA2抗体与HUVECs细胞表面ANXA2之间的相互作用力,结果显示,在细胞表面单位面积内,ESI09预处理后的HUVECs细胞表面所得ANXA2抗体与细胞表面ANXA2作用力减少,间接反映Epac1功能抑制后的内皮细胞细胞表面ANXA2的表达量下降。5、Epac1通过调控ANXA2和S100A10的结合影响ANXA2在细胞膜的表达免疫沉淀法富集去核后细胞成分内与S100A10关联的ANXA2,行蛋白免疫印迹法,半定量测定ANXA2,结果显示,相比对照组,ESI09处理后的去核细胞内S100A10相关ANXA2的蛋白含量减少。结论:1、Epac1基因敲除后小鼠纤溶功能减退提示Epac1参与调控纤溶系统。2、Epac1基因敲除影响小鼠血浆ANXA2表达含量。3、Epac1通过改变循环血ANXA2的含量影响小鼠纤溶功能。4、内皮细胞Epac1调控细胞膜表面ANXA2的表达。5、内皮细胞Epac1通过促进细胞膜内ANXA2和S100A10的结合,从而调控ANXA2在细胞膜表面的表达。综上所述,内皮细胞Epac1通过调控ANXA2在细胞膜表面的表达,参与调控纤溶系统。