研究背景:全世界有超过3.5亿人口慢性感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV),导致肝硬化、肝功能失代偿、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)一系列终末期肝病的高发,仍是一个世界性的公共卫生问题。慢性HBV感染多源自母婴传播及婴幼儿期HBV感染,根据病毒与宿主之间的相互作用可将HBV感染的自然史分为4期:免疫耐受期(immune tolerance phase,IT),免疫清除期(immune clearance phase),非活动期(inactive carrier state phase,IC)和再活动期(Reactivation phase)。处于免疫清除状态是常指的乙型肝炎病毒e抗原(Hepatitis B virus e antigen,HBeAg)阳性慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB),国内外CHB治疗指南均认为抗病毒治疗是最主要的治疗手段,能有效抑制病毒复制,减轻肝组织炎症损伤,延缓或阻止肝硬化、肝癌的发展。HBeAg血清学转换是评估抗病毒治疗疗效的重要指标之一,无论这种转换是自发的还是药物诱导的,均提示患者达到相对稳定的免疫控制状态,但临床上这类患者比率较低,许多患者即使经过长期的抗病毒治疗,HBV降至极低水平,仍未能出现HBeAg血清学转换,停止治疗后容易复发。研究提示,血清白细胞介素-12(IL-12)和IL-21、浆细胞样树突状细胞(pDC)的功能、CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)、滤泡辅助性T细胞(Tfh)和γδ双阴性T(γδ-DNT)细胞与HBeAg血清学转换有一定相关性,但所能回答的问题还较局限,其中的机制仍未阐明。一般认为,机体对HBV的控制不力是由于对HBV免疫应答低下,急性自限性乙型肝炎对HBV的清除和控制与广谱、强劲、多克隆特异性T细胞应答密切相关,相反,CHB中T细胞应答呈窄谱、微弱、寡克隆应答,这种应答甚至难以测及。报道中的DC、Treg和T细胞耗竭等因素均参与了 T细胞的应答低下,特别是CD8+T细胞的应答低下。CD8+ T 细胞根据 T 细胞受体(T cell receptor,TCR)分为 CD8+ TCRαβ+ T(CD8+αβT)细胞和CD8+TCRγδT(CD8+γ8T)细胞,前者占CD8+T细胞的绝大多数,高表达CD8;后者仅占CD8+T细胞频数的3%左右,中低表达CD8,既往研究中的CD8+T细胞一般指CD8+αβ T细胞。CD8+T细胞应答作为特异性免疫应答的终末效应在控制病毒等胞内感染中起举足轻重的作用,主要是通过干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等细胞因子所介导的非溶解途径控制及清除病毒的复制。慢性HBV感染中,HBV特异性CD8+T细胞过度表达程序性死亡受体(PD-1)、CD244、Bim、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)等与其功能耗竭有关,但阻断这些抑制分子对CD8+T细胞功能的修复程度有限,相当部分患者也未见CD8+T细胞功能得到恢复,因此我们推测还存在其他介导CD8+T细胞功能低下的机制。NKG2A属于C型外源凝集素结构域家族的成员,可与Ⅱ型外源凝集素样跨膜蛋白家族成员的CD94形成异源性二聚体CD94/NKG2A,表达于自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)、NKT及γδT细胞,作为抑制受体介导细胞自身的抑制信号。NKG2A的配体主要是非经典主要组织相容性分子-Ⅰ(major histocompatibility complex-Ⅰ,MHC-Ⅰ)类分子,包括小鼠Qa-1分子和人白细胞抗原-E(human leukocyte antigen-E,HLA-E)分子,研究显示 HLA-E 主要在人血细胞、肺、肾上腺、胎盘组织中高表达。人黑素瘤特异性CD8+T细胞上表达的NKG2A会抑制细胞本身的溶瘤作用;而淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染时,NKG2A会抑制T细胞的早期激活。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染者中NKG2A可介导对HCV特异性CD8+ T细胞应答的抑制作用,某些病毒肽如HCV aa35-44造成的肝内HLA-E的增加表达会抑制HCV特异性CD8+ T细胞应答,不利于对HCV的免疫清除,使用抗体阻断HLA-E/NKG2A途径可以促进HCV特异性CD8+T细胞功能。另外,HCV临床研究报道抗病毒治疗基线淋巴细胞上NKG2A的表达与治疗后是否获得持续应答相关。于是,本研究拟探讨NKG2A与HBV特异性CD8+T细胞应答的关系。研究目的:探讨NKG2A是否参与负调节HBV特异性CD8+T细胞应答,而其表达是否与HBV感染不同临床状态相关。研究方法1.研究对象本研究遵从赫尔辛基宣言(The Declaration of Helsinki),获得南方医科大学伦理委员会的批准,研究对象均已签署知情同意书。所有研究对象均排除以下情况:(1)一年内接受过干扰素治疗;(2)合并感染人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)或戊型肝炎病毒(HEV);(3)合并甲状腺功能亢进、糖尿病等代谢性或免疫缺陷性疾病;(4)合并恶性肿瘤;(5)影像学或组织学检查提示肝硬化。1.1横向研究:纳入61例受试者,包括3组共43例慢性HBV感染患者及18例健康对照(healthy controls,HC)。慢性HBV感染者的分组标准参考2013年AASLD的自然史分期,分别为IT患者(10例)、CHB患者(21例)及IC患者(12例)。所有患者均乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)阳性持续6个月以上,年龄在18-60岁。1.2纵向研究:纳入对象来源于一项替比夫定(Telbivudine,LdT)优化治疗的多中心开放性临床试验(EFFORT,the Efficacy Optimization Research of Telbivudine Therapy trial,trial NCT00962533)中的 10 例 CHB 患者。纳入标准和排除标准同横向研究CHB组。根据治疗52周时是否发生HBeAg血清学转换及血清HBV DNA定量是否<300 copies/mL将研究对象分为完全应答组(complete response,CR)和不完全应答组(non-complete response,NCR),分别选取5例,检测基线、12周、24周及52周的PBMC标本；另扩大两组基线样本数分别达到各10例,要求基线资料患者年龄、性别、HBV DNA、HBsAg、ALT、AST、HBV基因型构成比均衡,以排除这些混杂因素的影响。1.3肝组织(11例）均来源于临床肝穿及手术切除的活检标本,为满足常规病理组织分析诊断需要后的剩余标本。1.4功能研究：纳入45例对象均为南方医院门诊随访患者,纳入标准为：HBsAg阳性,HBeAg阳性,乙肝病毒e抗体(Hepatitis B virus e antibody,anti-HBe)阴性。探讨NKG2A与HBV特异性CD8+ αβ T细胞功能的关系：HBV核心肽库特异性CD8+T细胞应答阳性患者或HLA-A2阳性core18-27应答阳性患者的筛选。筛选方法如下：1.4.1短肽合成：HBV C区18-mer重叠多肽库(C区多肽库含盖了HBVC-ORF,相邻肽重叠lOaa,core peptides pool,cores）,core18-27 (FLPSDFFPSV)作为特异性刺激物,合成肽的纯度达95%以上。1.4.2实验孔分组：采集CHB患者SmL肝素抗凝血,IOOUL标记anti-HLA-A2阳性,剩余Ficoll分离液密度梯度法分离PBMC,在U型96孔板上按每孔4×105PBMC/200μLL扩增培养基(含10%FBS、1μg/mL anti-CD28和1μg/mL anti-CD49d抗体的1640培养基）铺板,每孔分别按“表1”加入刺激物,培养10天, 第4天加入IL-2 (25IU/mL)。1.4.3 检测采用胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining,ICS):10天后离心去上清,加入含10%FBS 1640培养基重悬,按“表1”加入刺激物,1h后加入brefeldin A(BFA,终浓度1μg/mL)再培养5h,收集细胞加入anti-CD3-FITC、anti-CD8-APC-Cy7进行表型标记,依次细胞洗涤、固定和破膜后加入anti-IFN-γ-PE进行标记,之后流式细胞仪检测和分析CD8+αβ T细胞中IFN-y的产生。2.PBMC 及肝脏浸润淋巴细胞(Liver-infiltrating lymphocytes,LIL)表面HLA-E、NKG2A分子表达水平的测定:荧光抗体标记检测:anti-CD3-APC-Cy7(UCTH1)、anti-TCRγδ-FITC(11F2)、anti-CD8-PerCP、anti-NKG2A-PE 和(或)anti-HLA-E-APC。3.CHB患者中NKG2A的表达与CD8+αβ T细胞功能的关系3.1非特异性刺激:采用anti-CD3及anti-CD28抗体进行非特异性刺激,比较NKG2A+CD8+αβ T 及 NKG2A-CD8+αβ T 细胞 IL-2、TNF-α 及 IFN-y 产生和细胞增殖水平的差异。3.1.1细胞因子的检测:应用的荧光抗体为anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD8-FITC、anti-NKG2A-APC、anti-IL-2-PE、TNF-α-PE-Cy7 和anti-IFN-γ-Percp-Cy5.53.1.2细胞增殖的检测:在加入刺激物之前,PBMC先用CFSE(1.5μmol/L)标记,检测时采用的荧光抗体为anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD8-APC。3.2特异性刺激:选择HLA-A2(+)并能够测及core18-27特异性CD8+aβ T细胞应答的患者,研究NKG2A的表达是否与HBV特异性CD8+αβ T细胞应答低下相关:Cores联合core18-27刺激10d后,采用ICS检测:表面标记抗体为anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD8-Percp 和 HBV core18-27-多聚体-PE(pentamer 或streptamer,core18-27-PE),胞内标记抗体为 anti-IFN-y-APC,检测NKG2A+core18-27+CD8+αβ T 及 NKG2A-core18-27+CD8+αβ T 细胞亚群功能的差异。4.阻断HLA-E/NKG2A途径,对HBV特异性CD8+αβT细胞功能的影响:4.1剔除NK细胞和γδ T细胞的阻断实验:鉴于PBMC中NK和γδ T细胞均高表达NKG2A,故先从1×107 PBMC中,采用γδT细胞磁珠(TCRyδ MicroBeads)分选试剂盒、NK细胞磁珠(CD56MicroBeads)和LD柱去除γδT细胞及NK细胞,细胞标记为yδT(-)NK(-)PBMC。阻断实验:使用anti-NKG2A(Z199,10μg/mL)及 anti-HLA-E(3D12,0.5mg/mL)分别预孵育封闭 5×105γδT(-)NK(-)PBMC 上表达的 NKG2A 及 HLA-E,core18-27 刺激培养 10d。ICS 检测:表型标记抗体为 anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD8-PerCP 和 core18-27-PE,胞内标记抗体为anti-IFN-y-APC。4.2 CD8+αβ T细胞阻断实验:磁珠分选CD8+αβ T细胞方法如下:1×107 PBMC采用γδT细胞磁珠分选试剂盒和LD柱去除γδ T细胞,细胞标记为γδT(-)PBMC,再采用anti-CD8磁珠(CD8 MicroBeads)和LS柱阳性分选出CD8+αβ T细胞,剩余细胞为γδT(-)CD8(-)PBMC。阻断实验:3×105 CD8+αβ T细胞与anti-NKG2A预孵育封闭CD8+αβ T细胞上表达的NKG2A,再与3×105 γδ T(-)CD8(-)PBMC混合,core18-27刺激培养10d,ICS检测同4.1。4.3总PBMC阻断实验:使用anti-NKG2A及anti-HLA-E分别孵育封闭5×105 PBMC,core18-27 刺激培养 10d,ICS 检测同 4.1,胞内加标 anti-TNF-α-PE-Cy7。5.统计学分析:HBVDNA转换为log10值进行分析,数据不符合正态性检验者,以中位数(范围)表示,计数资料采用Chi-Square Tests(Continuity correction);计量资料根据不同数据采用相应的统计学分析方法,包括:多个独立样本非参数检验的Kruskal-Wallis H test、两个独立样本的非参数统计检验Mann-Whitney U test、多个相关样本的非参数检验Friedman test、两相关样本的非参数检验Wilcoxon Test;所用统计学软件包括SPSS13.0和GraphPad Prism 5,统计学水准双侧检测、P<0.05为统计学差异有显著性。结果1.NKG2A在CD8+αβ T细胞上的表达:8例LdT治疗104周患者LIL CD8+αβ T细胞上NKG2A表达均明显高于PBMC(P<0.001);HLA-A2(+)的 3 例 LIL 及 5 例 PBMC,Core18-27+CD8+αβ T细胞NKG2A的表达均高于Core18-27-CD8+αβ T细胞。2.NKG2A的表达与CD8+αβ T细胞功能的关系2.1.NKG2A与非特异性CD8+αβ T细胞功能及增殖能力的关系4例CHB患者PBMC的CD8+αβ T细胞中,NKG2A+亚群细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-2)的分泌及增殖能力均低于NKG2A-亚群;2例LIL的CD8+αβ T细胞中,NKG2A+亚群IFN-γ的分泌也均低于NKG2A-亚群。2.2 NKG2A的表达与HBV特异性CD8+αβ T细胞功能的关系2.2.1 HBV特异性CD8+ T细胞应答患者的筛选:共筛选45名门诊随访患者,其中能够测及HBV特异性CD8+T细胞应答患者12例。2.2.2 NKG2A的表达与HBV特异性CD8+αβ T细胞应答低下相关:5例HLA-A2(+)患者 PBMC 的 core18-27+CD8+αβ T 细胞中,NKG2A+亚群 IFN-γ 的分泌均低于NKG2A-亚群(P=0.043).3.阻断HLA-E/NKG2A途径可促进HBV特异性CD8+αβ T细胞应答。3 例 HLA-A2(+)患者的 γδ T(-)NK(-)PBMC 分别采用 anti-NKG2A 及anti-HLA-E进行阻断后,core18-27+CD8+αβ T细胞IFN-γ的分泌均增加。3例HLA-A2(+)患者的CD8+αβ T细胞采用anti-NKG2A进行阻断后,core18-27+CD8+αβ T细胞IFN-γ的分泌均增加。5例具有HBV特异性应答患者的PBMC分别使用anti-NKG2A及anti-HLA-E封闭并采用cores特异性刺激后,部分患者CD8+αβ T细胞IFN-γ及TNF-α的分泌有不同程度的增加。4.横向研究:尽管4组人群总体未见显著性统计学差异(P=0.120),但两两比较中,CHB 组(P = 0.046)及 IC 组(P = 0.017)CD8+αβ T 细胞上NKG2A 的表达频数均显著高于HC组,IT组也有高于HC组的趋势(P=0.308);而淋巴细胞表达HLA-E的频数在总体中具有显著性差异(P=0.006),CHB组(P=0.001)、IC组(P=0.028)及IT组(P=0.045)均显著高于HC组;HBV感染各组间均未见显著差异。5.NKG2A和HLA-E在抗病毒治疗过程中的动态变化及与1临床转归的关系CR组(n=10)基线PBMC的CD8+αβ T细胞上NKG2A的表达频数显著低于NCR组(n=10,P=0.023),其他各时间点均未见统计学差异;而淋巴细胞上HLA-E的表达频数在各时间点均未见明显差异。结论CHB患者中,HBV特异性CD8+αβ T细胞上NKG2A的表达增加或淋巴细胞上HLA-E的表达增加可能与HBV特异性CD8+αβ T细胞功能低下有关,阻断HLA-E/NKG2A可促进HBV特异性CD8+αβ T细胞应答,提示NKG2A作为抑制性受体参与介导了 HBV特异性CD8+αβT细胞功能低下。而抗病毒治疗基线时CD8+αβ T上NKG2A的表达可能与抗病毒治疗的疗效相关。