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贻贝(Mytilus edulis)是一种蛋白质含量很高的海洋贝类。我国是世界上贻贝产量最大的国家,采用酶解法对食源性蛋白进行定向水解释放抗血栓活性肽段,具有条件温和,成本低,安全性高,酶解产物易消化吸收,可以充分利用贻贝资源的优势。本研究分别选用不同的蛋白酶对贻贝蛋白进行水解,将其水解成不同的多肽片段,进而筛选出高抗血栓活性水解产物,采用UPLC-Q-TOF对水解产物进行肽段鉴定,通过分子对接、构效关系分析和同源性比对等生物信息学方法预测肽段的抗血栓活性,对筛选的多肽进行生物合成及结构鉴定,并进一步通过体外实验阐述其抗血栓机制,主要研究内容及成果如下:首先通过贻贝蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶及中性蛋白酶水解作用研究,确定了最佳水解酶为蛋白酶,并对其最佳水解条件进行了优化。Tricine-SDS-PAGE电泳研究表明,所选的几种蛋白酶中,胰蛋白酶酶解液降解最为显著,且该条件下酶解产物凝血酶抑制率活性最高,为72.51±6.80%,因此确定蛋白酶种类为胰蛋白酶。在此基础上通过单因素试验确定加酶量、底物浓度、酶解pH和酶解温度四个酶解因素的适宜范围,并进一步通过正交设计方法,以凝血酶抑制率为指标,对胰蛋白酶酶解液样品在加酶量(2500 U/g,5000U/g,7500 Ug)、底物浓度(3.3%,2.5%,2.0%)、酶解pH(7.5,8.5,9.5)和酶解温度(37?C,41?C,45?C)条件下设计四因素三水平酶解实验,最终确定贻贝最佳酶解条件为:加酶量5000 U/g,底物浓度2.5%,pH 8.5,温度45?C。在此条件下浓度为1 mg/mL酶解产物的凝血酶抑制率为76.92±4.66%。然后对凝血酶抑制活性最高的酶解产物采用UPLC-Q-TOF法鉴定得到39条贻贝肽段,预测所有肽段均无致毒性,将鉴定得到的肽段及阳性对照水蛭素(肽段54-65)分别与凝血酶进行半柔性分子对接,得到各多肽对接的结合能,并将多肽与本地数据库中抗血栓多肽进行同源性比对。结合多肽构效关系,综合筛选四种预测手段确定的高活性抗血栓肽,确定Peptide 26(KNAENELGEVTVR)和Peptide36(NAESLRK)具有较高抗血栓活性及研究价值,作为下一步的研究对象。最后将预测得到的两条抗血栓Peptide 26(KNAENELGEVTVR)和Peptide 36(NAESLRK)进行固相生物合成,对其进行纯度和序列鉴定,HPLC结果显示二者的纯度分别为99.21%和99.27%,纯度较高,经UPLC-Q-TOF法鉴定合成序列无误;采用傅里叶变换红外光谱分析合成肽的二级结构,发现二者在酰胺I带都具有β-折叠二级结构;分别测定两个多肽在1 mg/m L~7 mg/mL浓度条件下的凝血酶抑制活性,在浓度为7 mg/m L时Peptide 26和Peptide 36的凝血酶抑制率分别为86.96±5.30%、81.32±7.12%,均显示了较高的凝血酶抑制活性;采用等温滴定量热法测定Peptide 26和Peptide 36与凝血酶的相互作用,二者与凝血酶的结合分别为强、弱结合,可自发进行并形成氢键,均以疏水作用作为主要驱动力;测定合成肽Peptide 26和Peptide 36的凝血四项指标,发现二者在内源性及外源性两个途径上均对血栓有显著的抑制作用。