第一部分SF-HAp/SDF-BMP支架的制作及其材料结构和性能表征【目的】构建能序贯释放SDF-1和BMP-2的SF/HAp生物支架,并评估相关物理和化学性能。【方法】选择高压静电喷射法制作丝素微球。对2%、4%、6%和8%浓度的SF溶液来制作微球通过SEM和粒径分析的方法筛选出合适的SF溶液浓度。按照n HAp/SF质量比分别为1:2、1:4、1:10和1:20的比例,采用超声震荡和磁性搅拌的方法,根据固液相分离情况筛选出合适的n HAp/SF质量比以制备SF-HAp混悬液。采用冷冻干燥以及甲醇浸泡的方法制备支架,分别通过物理吸附和微球包封的方法在各组支架中负载不同的细胞因子,从而将支架分成六组:空白支架组（Control组）、物理吸附SDF-1组（SDF-1组）、物理吸附BMP-2组（BMP-2（P）组）、缓释BMP-2组（BMP-2（E）组）、物理吸附SDF-1和BMP-2组（S+B（P）组）和序贯释放SDF-1和BMP-2组（S+B（E））。采用SEM扫描所得的图像结合Nano Mesurer软件分析微球粒径和支架孔径分布情况,采用液体置换法评估支架的孔隙率,通过FTIR分析支架的化学基团和化学键,吸水率分析其亲水性能以及生物力学测试其力学性能。最后,采用ELISA法检测支架在3 h、12 h、24 h、4 d、7 d、10 d、13 d、19 d、25 d、31 d和34 d时SDF-1和BMP-2的释放量,评估其释放性能。【结果】经过SEM鉴定和粒径分析筛选,本研究最终采用6%的SF溶液用于微球制作,其制得的空白SF微球及负载BMP-2的SF微球粒径分别为127±29和131±33μm（P>0.05）;通过固液相分离法筛选,最终选用n HAp和SF以1:20的质量比配成混悬液。通过SEM扫描见支架整体呈海绵状,表面和切面均为蜂窝形态;粒径分析发现未载球时支架的孔径为124±42μm,而融入微球后下降到85±25μm,两者差异有显著统计学意义（P<0.05）。孔隙率的比较,Control组为49.3±7.4%,未载球组（SDF-1、BMP-2（P）和S+B（P）组）并没有明显改变（P>0.05）;载球组（BMP-2（E）和S+B（E））孔隙分别下降为41.2±6.9%和40.7±9.2%,相对Control组有所降低（P<0.05）。采用FTIR对SF和n HAp制作的微球和支架进行分析,发现波峰主要出现在1650 cm-1、1516 cm-1和1025 cm-1处,分别为SF和n HAp的特征峰,负载SDF-1和/或BMP-2对波峰影响不明显。吸水率的比较,各组之间均无明显差异（P>0.05）。生物力学测定显示六组支架的压缩模量均在12 k Pa左右,各组间差异无统计学意义（P>0.05）。SF-HAp/SDF-BMP支架（S+B（E）组）中,SDF-1在第1 d就突释了46.8±5.4%,在第7 d时累积释放84.7±3.3%;相较于SDF-1而言,BMP-2在该支架组中是缓慢而持续的,第1 d突释21.1±1.7%,持续释放时间超过4 w,累积释放74.4±1.1%。【结论】SF-HAp/SDF-BMP支架具备良好的孔径、孔隙率、亲水性能和力学性能,并且能够序贯释放SDF-1和BMP-2。第二部分SF-HAp/SDF-BMP支架促进BMSCs体外迁移和成骨分化的研究【目的】探讨SF-HAp/SDF-BMP支架促进SD大鼠BMSCs迁移、黏附、增殖以及成骨分化的能力。【方法】通过密度梯度法提取SD大鼠BMSCs,采用流式细胞技术和细胞免疫荧光对其表型进行鉴定,并通过成骨、成脂肪和成软骨诱导对BMSCs多系分化能力进行鉴定。设立Control、SDF-1、BMP-2（P）、BMP-2（E）、S+B（P）和S+B（P）组进行对照研究。选用第三代BMSCs,检测支架的生物相容性,将细胞种植在支架上,在第1、5和9 d,用SEM观察细胞在支架上的黏附形态和长入情况;在第1、3、5、7和9 d,用CCK-8法检测细胞增殖率。通过Transwell方法检测支架促进细胞迁移的能力。采用Transwell板将细胞与各组支架共培养,通过FITC-Phalloidin和DAPI荧光染色,观察BMSCs成骨分化时骨架和胞核形态变化;分别用ALP染色、茜素红染色、OCN细胞免疫荧光染色的方法定性鉴定支架促进细胞成骨分化的作用;采用RT-q PCR的方法半定量检测BMSCs成骨分化各期相关基因ALP、RunX2、OPN和OCN在第3、7和14 d的表达。【结果】提取的BMSCs经过表型鉴定,表面抗原CD44、CD90和CD29表达分别为96.42%、94.14%和86.10%;CD11b、CD45和MHC-II分别为2.33%、0.87%和1.32%;CXCR4既在细胞表面也在细胞内表达,分别为39.86%和15.07%;BMSCs经过诱导后成功进行成骨、成脂肪和成软骨三系分化。BMSCs在各组支架上黏附良好,在BMP-2缓释支架上（S+B（E）和BMP-2（E）组）增殖能力最强,与Control组相比差异有显著统计学意义（P<0.01）。负载BMP-2和SDF-1的支架均有促进细胞迁移的作用,但是负载SDF-1的支架（SDF-1、S+B（P）和S+B（E）组）作用更强,相对于其余三组差异有显著统计学意义（P<0.01）,但是SDF-1、S+B（P）和S+B（E）组之间差异没有统计学意义（P>0.05）。支架诱导BMSCs成骨分化5 d后,细胞核及骨架染色观察可见S+B（P）和S+B（E）组中细胞的数量相对增多,活力更好;7 d后,ALP染色显示含有BMP-2的四支架组与Contorl和SDF-1组相比,细胞染色更深,但是四组之间差别不明显;21 d后,茜素红染色表明BMP-2（E）组和S+B（E）组中不仅细胞数量多,而且钙化结节染色深,局部还出现钙结节相互融合的现象,而S+B（E）组比BMP-2（E）组中染色钙结节的分布面积更大;OCN免疫荧光染色结果显示OCN表达的荧光亮度BMP-2（E）、S+B（P）和S+B（E）组明显高于其余各组,其中S+B（E）组>BMP-2（E）组>S+B（P）组。基因表达方面,其中ALP和Run X2的表达具有相似性,在各时间点,负载BMP-2的四个支架组中与Control组相比均有显著提高,S+B（E）组在第7和14 d表达最高;OPN和OCN的表达也具有相似性,在第3 d各组间的表达差异无统计学意义（P>0.05）,到第7和14 d时,在载有BMP-2的四组支架中表达开始升高,其中顺序是S+B（E）>BMP-2（E）>S+B（P）>BMP-2（P）,而S+B（E）组与BMP-2（E）组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。【结论】SF-HAp/SDF-BMP支架生物相容性良好,能促进细胞在支架上黏附、增殖;在体外有促进BMSCs迁移的作用,具备良好的促进BMSCs成骨分化的能力。第三部分SF-HAp/SDF-BMP支架促进BMSCs在大鼠体内迁移及其修复颅骨缺损的研究【目的】探讨SF-HAp/SDF-BMP支架促进BMSCs在SD大鼠体内迁移、归巢作用以及支架修复颅骨缺损的可行性。【方法】利用携带萤火虫荧光素酶（Luc）报告基因的慢病毒对SD大鼠BMSCs完成标记,获得Luc-BMSCs,分别按1、2、5、10、15、20、25、30、50、80等不同感染复数进行筛选以确定最佳感染复数。建立大鼠颅骨缺损模型,以SDF-1为阳性药物,通过尾静脉注射Luc-BMSCs,在小动物活体成像仪下,观察第3 d颅骨缺损位置细胞的聚集程度,并通过采用不同细胞浓度注射的方法确定合适的细胞注射量。然后继续建立大鼠中央颅骨缺损模型,将支架植入模型中,通过尾静脉注射Luc-BMSCs,于注射完30 min、1 d、3 d、7 d、14 d和28 d后在小动物活体成像仪的观察下记录Luc-BMSCs的迁移途径,以及在支架部位的归巢和增殖情况。再次建立大鼠双侧颅骨缺损模型,植入支架,在术后8 w和12 w通过在μ-CT结合组织切片评价大鼠颅骨缺损模型在支架作用下的骨长入,在术后12 w取颅骨标本进行组织切片及H&E染色,观察新骨形成、血管形成以及支架降解情况。【结果】带Luc标签的慢病毒表达载体Lenti-Luciferase,浓度为650 ng/μL,OD260/280=1.9,通过慢病毒感染BMSCs的体外生物发光检测确定最佳感染复数为50;根据不同浓度细胞注入后,根据小动物活体成像仪测定第3 d大鼠中央颅骨缺损位置细胞聚集区的荧光强度,确认注射细胞量为1.0×106。未植入支架的大鼠颅骨中央缺损模型,经注射Luc-BMSCs 12 h后,取肾、肝、脾、脑等非循环系统重要脏器检测,发现细胞主要集中在肝脏和肾脏内,脑部无聚集,不影响颅骨缺损区的荧光强度。在大鼠颅骨中央缺损模型中植入各组支架后,注射Luc-BMSCs,在30 min和1 d后,Luc-BMSCs主要停留在肺部;第3 d时,各组大鼠肺部的荧光开始减弱,而颅骨缺损区的荧光都有所增强,以负载SDF-1的三组支架最为明显,而这三组之间并没有明显差异（P>0.05）;第7 d,各组颅骨缺损区的荧光强度均有下降,仍以负载SDF-1的三组支架荧光强度最强;第14 d,各组颅骨缺损区的荧光强度继续减弱,但是负载SDF-1的三组支架荧光强度仍较强,其中以S+B（E）组最强,与SDF-1组差异有统计学意义（P<0.05）。大鼠双侧颅骨缺损模型中植入支架8 w和12 w的μ-CT成像表明,支架植入处的新骨长入方式均是从边缘到缺陷中心,BMP-2（E）和S+B（E）组与其他4组支架相比,骨含量明显增加,到第8 w实现新骨的大部分长入。而第12 w时BMP-2（E）和S+B（E）组BV/TV分别为31.21±3.50%和53.78±9.84%,组间差异有统计学意义（P<0.05）,S+B（E）组实现新骨对缺损区的完全覆盖。组织病理学H&E染色结果显示移植12 w之后,S+B（E）组形成了典型的新骨,并且与其他组相比,形成了更厚的骨基质,残留的支架明显减少,骨组织中可见较多的血管形成。【结论】SF-HAp/SDF-BMP支架序贯释放SDF-1和BMP-2可以在体内招募Luc-BMSCs归巢并且具有良好的促新骨形成能力,新骨形成与支架降解速度相匹配。