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冠脉血栓事件发生之前,冠心病患者体内就存在着一系列有利于血栓形成的病理改变,即血栓前状态。冠心病血栓前状态的形成是多种病理因素综合作用的结果,最终可使机体的促凝-抗凝功能失衡进而促使冠脉内血栓形成,导致急性心血管事件的发生。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的短链非编码RNA,具有微调控、多靶点的作用特点,在心血管疾病中发挥重要调节作用。研究表明,miRNAs可从多个方面参与调控冠心病血栓前状态的发生发展,包括调控内皮功能、调控血小板活化与聚集、调控炎症反应以及凝血/纤溶功能等。冠心病血栓前状态相关miRNAs的筛选对于识别和治疗冠心病血栓前状态进而预防血栓事件的发生有着重要意义。川芎嗪为活血化瘀中药川芎的主要有效成分之一。课题组前期研究表明,川芎嗪具有保护血管内皮、减轻炎症反应、抗血小板活化、稳定斑块等作用,并且在临床中能显著减轻冠心病患者心绞痛症状并改善心脏功能。而川芎嗪是否可以通过调控相关miRNAs干预冠心病血栓前状态?目前尚缺少相关研究。基于此,我们提出了“川芎嗉通过调控相关miRNAs能够有效改善冠心病血栓前状态”的假说,并围绕假说进行了两方面的研究:(1)筛选与冠心病患者血栓前状态相关的目标miRNAs;(2)基于研究(1)的结果,探讨川芎嗪调控冠心病血栓前状态目标miRNAs干预大鼠冠脉微血栓的效应和机理。研究一冠心病患者血栓前状态相关microRNAs研究目的:筛选并验证与冠心病患者血栓前状态相关的目标miRNAs,为冠心病血栓前状态的辨识和机理研究提供分子依据。方法:研究纳入稳定性冠心病患者作为病例组,并按照血小板最大聚集率(MPAR)和甲襞微循环检测的结果分组:MPAR≥65%且甲襞微循环中-重度异常的患者纳入冠心病血栓前状态(PTS)组、MPAR<65%且甲襞微循环正常或轻度异常的患者纳入冠心病非血栓前状态(Non-PTS)组、MPAR≥65%且甲襞微循环正常或轻度异常的患者纳入冠心病伴高血小板聚集率(HMPAR)组,MPAR<65%且甲襞微循环中-重度异常的患者纳入冠心病伴微循环障碍(MD)组;同时,研究纳入与病例组年龄、性别相匹配的健康志愿者作为对照组。研究分两个阶段进行:(1)筛选阶段最终入组40例受试者,包括PTS组10例、Non-PTS组8例、HMPAR组9例、MD组8例和健康对照组5例。提取受试者外周血单核细胞内的总RNA,利用miRNA芯片技术检测4个病例组相较于健康对照组的差异表达miRNAs并进行组间比较分析,然后通过12个靶基因预测软件对差异miRNAs的靶基因进行预测,构建差异miRNAs与靶基因的调控网络,筛选出与冠心病血栓前状态相关性更大的miRNAs进入验证阶段。(2)验证阶段最终入组98例受试者,包括PTS组40例、Non-PTS组39例和健康对照组19例。提取受试者外周血淋巴细胞内的总RNA,利用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术验证所选miRNAs在PTS组的差异表达,确立冠心病血栓前状态相关的目标miRNAs。结果:与健康对照组比较,病例组中共检测到32个差异表达的miRNAs,其中10个miRNAs表达上调,22个miRNAs表达下调。上述差异miRNAs通过软件共预测到57726个靶基因,其中690个靶基因与27个差异miRNAs之间具有网络调控关系。依据芯片结果的组间比较分析和miRNA-靶基因调控网络图,将miR-34a-5p、miR-370-3p、miR-432-5p 和 miR-495-3p 纳入 RT-qPCR 验证,其中 miR-34a-5p、miR-370-3p 和miR-432-5p表达上调,miR-495-3p表达下调。RT-qPCR结果显示与健康对照组相比,miR-34a-5p、miR-370-3p、miR-495-3p 和 miR-432-5p 在 PTS 组和 Non-PTS 组中均为高表达(P<0.05 或P<0.01);与 Non-PTS 组相比,PTS 组中 miR-34a-5p 和 miR-495-3p呈高表达(P<0.01,P<0.05),而miR-370-3p和miR-432-5p的表达差异不显著(P>0.05)。其中miR-34a-5p差异表达的趋势与芯片结果一致,而miR-495-3p差异表达的趋势与芯片结果不符。结论:miR-34a-5p在冠心病血栓前状态患者体内高表达,与冠心病血栓前状态相关。研究二川芎嗪干预冠脉微血栓大鼠的效应和机理研究目的:观察川芎嗪通过调控miR-34a-5p对大鼠冠脉微血栓形成以及内皮功能紊乱、血小板活化、炎症反应相关指标和心功能的干预效应,并探讨其机理。方法:90只健康雄性SD大鼠,随机分为6组:假手术组(Sham),模型组(Model),氯吡格雷组(Clopidogrel),川芎嗪组(Ligustrazine),川芎嗪+miR-34a-5p模拟剂组(Ligustrazine+miR-34a-5p agomir),川芎嗪 +miR-34a-5p 模拟剂阴性对照组(Ligustrazine+agomir NC),每组15只。Sham组和Model组大鼠每天给予等量纯净水灌胃,Clopidogrel组大鼠每天给予氯吡比格雷6.75mg/kg灌胃,其余3组大鼠每天给予川芎嗪27mg/kg灌胃,连续干预4周后采用左心室注射月桂酸纳的方法建立冠脉微血栓模型(Sham组注射等量生理盐水)。在川芎嗪灌胃的基础上,Ligustrazine+miR-34a-5p agomir组和Ligustrazine+agomir NC组大鼠分别在造模前5天和2天给予颈静脉注射miR-34a-5p agomir和agomir NC 50nmol/只。造模24小时后,通过颈动脉插管检测大鼠心脏血流动力学改变,包括左心室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩末压(LVSP)、心室内压上升和下降的最大速率(+dp/dtmax,-dp/dtmax)、心率(HR);HE染色观察冠脉微血栓发生率和心肌炎性浸润;光比浊法检测血小板最大聚集率(MPAR);ELISA法检测血清肌钙蛋白I(cTn-I),内皮素1(ET-1)、血管性血友病因子(vWF)、血浆P选择素(P-Selectin)以及环磷酸腺苷(cAMP),血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)以及基质金属蛋白酶9(MMP-9);RT-qPCR检测血浆和心肌组织内miR-34a-5p 及 Sirt1 mRNA 的表达;Western Blotting 法检测心肌组织中 Sirt1、eNOS 蛋白表达和NFκBp65磷酸化(phospho-)水平。结果:与Sham组相比,Model组大鼠LVEDP显著升高而LVSP和±dp/dtmax显著降低(P<0.01),冠脉微血栓发生率、心肌炎性细胞计数和血清cTn-I均显著升高(P<0.01);内皮损伤标志物(ET-1、vWF)、血小板活化标志物(MPAR、P-Selectin)以及相关炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1、MCP-1、MMP-9)的水平均显著升高(P<0.01),血浆cAMP水平显著降低(P<0.01);此外Model组大鼠血浆和心肌组织中的 miR-34a-5p 表达均上调(P<0.01),Sirt1 mRNA 表达均下调(P<0.01,P<0.05),心肌Sirt1及eNOS蛋白表达量降低(P<0.05)同时phospho-NFκB p65/NFκB p65比值升高(P<0.01)。与Model组相比,川芎嗪预处理后的大鼠血流动力学各项指标均有明显改善(P<0.01),冠脉微血栓发生率、心肌炎性细胞计数和血清cTn-I均显著降低(P<0.01),血浆cAMP水平明显回升(P<0.05),其他内皮损伤标志物、血小板活化标志物以及相关炎症因子水平均显著降低(P<0.01或P<0.05);同时血浆和心肌组织中的miR-34a-5p表达均显著下调(P<0.01),Sirt1 mRNA表达均显著上调(P<0.05,P<0.01),心肌Sirt1及eNOS蛋白表达量明显增加(P<0.05),phospho-NFκB p65/NFκB p65比值显著降低(P<0.01)。在川芎嗪的基础上应用miR-34a-5pagomir使大鼠体内miR-34a-5p表达上调,可在一定程度上拮抗川芎嗪对大鼠内皮功能、血小板活化和炎症反应的干预效应以及对心功能的保护效应(P<0.01或P<0.05),抑制血浆和心肌组织内Sirt1 mRNA表达(P<0.01,P<0.05),同时使心肌Sirt1及eNOS蛋白表达量降低(P=0.058,P<0.05)、phospho-NFκBp65/NFκBp65 比值升高(P<0.01)。Ligustrazine+agomirNC 组大鼠除了血浆Sirt1 mRNA和心肌eNOS蛋白表达略低于Ligustrazine组(P<0.05),其余指标无显著组间差异。此外,氯吡格雷降低血清cTn-I和IL-6水平的效应略优于川芎嗪(P<0.05),两种药物对其余指标的干预效应无显著差异。结论:冠脉微血栓形成大鼠存在明显的血管内皮损伤、血小板活化、炎症反应及心肌损伤,血浆及心肌组织miR-34a-5p表达上调;川芎嗪具有减少冠脉微血栓形成、改善内皮功能、抗血小板、抗炎和保护受损心肌的作用,其机制与抑制miR-34a-5p表达、促进Sirt1 mRNA和蛋白表达进而增加eNOS表达、抑制NFκB激活有关。