[背景与目的]　　 ABCG2转运子(ATP-Binding Cassette Family G2 Transporters)亦称乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistant protein，BCRP），是由ABC基因家族编码的细胞膜转运蛋白。ABCG2基因定位于人类染色体4q22，编码655个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白。该类蛋白均有ATP结合位点，通过水解ATP提供能量将底物逆势转运至细胞膜外或细胞器中，其转运底物包括各种药物/毒素及其代谢物、生理代谢物、营养物、脂类和多肽等。众多研究显示，ABCG2在大多数正常组织中高表达，包括脑、肠道、肝、胎盘、生殖腺和骨髓等组织，从而保护这些组织免于药物及毒物的影响，对维持人体正常生理功能和减轻病理损伤起着至关重要作用。本课题组多年来一直从事ABCG2的研究，并首次发现ABCG2具有保护细胞免受活性氧(reactive oxygen species，ROS)诱导的细胞损害的作用。本研究在此基础上，进一步研究了ABCG2在ROS诱导的细胞损伤中的作用及其可能涉及的信号通路，为深入探讨ABCG2在H2O2诱导的氧化应激中的保护作用及其可能机制提供了重要的实验依据。同时初步探究了ABCG2在阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)发病过程中的保护作用，以期进一步明确AD的发病机制及为AD的预防提供实验依据。　　 [方法]　　 1．ABCG2-pTT5SH8Q2重组质粒的构建、扩增、鉴定及重组质粒在细胞内（人胚肾上皮细胞HEK293及小鼠成神经细胞瘤细胞株N2a-695）的表达和表达效率的鉴定（Western blot，免疫荧光）。(pTT5SH8Q2空载质粒，以下简称PTT)　　 2．ROS assay及抗氧化能力测定实验分别检测ABCG2在过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)和/或叔丁基过氧化氢（tert-Butyl hydroperoxide，TBHP）诱导的细胞内ROS的产生及细胞抗氧化能力变化过程中的作用。　　 3．PI assay（Propidium Iodid，碘化丙啶）检测ABCG2在H2O2诱导的细胞毒性中的作用。　　 4．RT-PCR及RT-qPCR检测ABCG2对H2O2诱导的炎症因子（IL-8，GRO或GRO-β）mRNA表达中的影响。ELISA进一步检测ABCG2在H2O2诱导的IL-8蛋白分泌中的影响。　　 5．Western blot检测ABCG2在H2O2诱导的细胞内NF-κB信号通路中的作用，体内实验中Western blot检测NF-κB信号通路在Abcg2基因敲除及野生型小鼠中的表达情况。　　 6．血红素转运实验及ROS assay分别检测ABCG2对氯化血红素(hemin chloride)在细胞转运中的作用及其对氯化血红素诱导的ROS产生中的作用。　　 7．Western blot检测ABCG2在AD、AD合并脑淀粉样变性血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)及年龄相仿的无痴呆(No dementia，ND)脑组织中的表达情况。　　 8．活体扫描检测ABCG2对β-淀粉样蛋白1-40（amyloid peptide1-40，Aβ1-40）进出Abcg2基因敲除小鼠及野生型小鼠血脑屏障的影响。免疫荧光进一步检测不同小鼠脑内Aβ1-40的沉积情况。　　 9．Western blot及RT-PCR分别检测氧化应激条件下，ABCG2对高表达β-淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）的N2a-695细胞中APP表达的影响。Aβ1-40ELISA进一步检测相同条件下，ABCG2对N2a-695细胞内Aβ1-40产生的影响。　　 10.分泌酶测定实验检测氧化应激条件下，ABCG2对N2a-695细胞中α-，β-，γ-分泌酶活性的影响。　　 [结果]　　 1．成功构建ABCG2-PTT重组质粒，限制性内切酶酶切及DNA测序均证实质粒构建成功，序列正确。Lipofectamine2000转染ABCG2-PTT重组质粒入HEK293及N2a-695细胞，Western blot提示重组质粒转染入HEK293细胞48h后，ABCG2蛋白表达达到峰值。故本研究中，均在确保重组质粒在细胞中表达48h后行后续实验。原位免疫荧光显示该重组质粒在两种细胞中的表达效率均为60％以上。　　 2.ROS assay实验结果显示，与未加H2O2的对照组(H2O)相比，H2O2(0.5，1，2μM；2h)及TBHP(100μM;2h)均能明显诱导HEK293细胞内ROS的产生（P＜0.05），而ABCG2能抑制这一过程中细胞内ROS的产生（P＜0.05）；抗氧化能力测定实验结果显示ABCG2可增加H2O2(2μM;6h)诱导的氧化应激反应下细胞的抗氧化能力（P＜0.05）。　　 3．PI assay实验结果显示，与对照组(H2O)相比，H2O2(0.5，1，2μM;2，6，16h)能诱导明显的细胞毒作用(P＜0.001)，而ABCG2能抵抗H2O2(2μM;16h)诱导的细胞毒作用(P＜0.001)。　　 4．RT-PCR实验结果显示，与对照组(H2O)相比，H2O2(0.5，1，2μM；2，4，6h)明显诱导HEK293细胞中炎症因子(IL-8，GRO)mRNA表达(P＜0.05)。RT-qPCR实验结果亦证实，和对照组(H2O)相比，H2O2(0.5，1，2μM;6h)能明显诱导HEK293细胞中IL-8和GRO-β基因的表达(P＜0.05)，而ABCG2能减少这一过程中IL-8、GRO-β的表达(P＜0.01)。ELISA实验结果在蛋白水平进一步证实，和对照组(H2O)相比，H2O2(1μM;6h)能明显诱导HEK293细胞中炎症因子IL-8的分泌(P＜0.001)。与PTT空载处理组相比，ABCG2能够明显减少H2O2诱导的IL-8的分泌（P＜0.05）。　　 5．Western blot实验结果显示，与对照组(H2O)相比，H2O2(0.5，1，2μM;2h)明显诱导HEK293细胞中NF-κB信号通路的活化(P＜0.05)，而ABCG2能抑制细胞内H2O2诱导的NF-κB信号通路的活化（P＜0.01）。体内实验中，与野生型小鼠相比，Abcg2基因敲除小鼠的脑匀浆组织中，NF-κB信号通路活化显著增多（P＜0.01）。　　 6．血红素转运实验结果显示ABCG2能够减少血红素转运入细胞胞浆内（P＜0.05）。ROS assay显示血红素能够诱导细胞产生ROS(P＜0.01)，而ABCG2通过减少血红素进入细胞而降低其诱导的细胞内ROS的产生(P＜0.001)。　　 7．Western blot实验结果显示，与正常年龄相仿的ND正常人脑组织相比，AD以及AD/CAA患者脑组织中ABCG2的蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)。　　 8．活体扫描实验结果及后续小鼠脑组织的免疫荧光结果均显示，与野生型小鼠相比，Abcg2基因敲除小鼠脑内Aβ1-40沉积明显增加。提示ABCG2能够阻止Aβ1-40通过血脑屏障进入小鼠脑内（P＜0.05）。　　 9，Western blot实验结果显示，H2O2（2μM;4，6h）能够诱导N2a-695细胞中APP的酶解（P＜0.05），而ABCG2可减少这一过程中N2a-695细胞内APP的酶解(P＜0.05)。RT-PCR结果显示，ABCG2对APP的基因表达无影响，因为APP基因已稳转入细胞，故能持续高表达。Aβ1-40ELISA实验结果进一步显示，ABCG2能够降低H2O2(1μM;4，6h)应激所致N2a-695细胞中Aβ1-40的产生(P＜0.01)。　　 10．分泌酶测定实验结果显示，与对照组(H2O)相比，H2O2(0.5，1，2μM；6h)能明显增加N2a-695细胞中a-，β-，γ-分泌酶的活性(P＜0.05)，而ABCG2能够明显减少氧化应激条件下N2a-695细胞内α-，β-，γ-分泌酶的活性(P＜0.05)。　　 [结论]　　 1．ABCG2通过抑制氧化应激条件下细胞内ROS的产生，增加细胞抗氧化能力，从而有助细胞抵抗ROS诱导的细胞毒作用；同时亦能抑制氧化应激条件下细胞内炎症因子（IL-8，GRO）的表达及分泌(1L-8)，从而发挥其抗炎症效应。ABCG2能发挥上述保护作用的可能机理是ABCG2能减少作为其转运底物之一的血红素（作为前氧化应激因子）进入细胞，从而减少血红素诱导的细胞内ROS的产生。　　 2．体外实验证实ABCG2在氧化应激中的保护作用可能是由NF-κB信号通路介导的，体内实验亦证实，ABCG2能抑制NF-κB信号通路的激活。　　 3．ABCG2在AD及CAA/AD患者脑内高表达，推测ABCG2可能在AD病理生理过程中发挥保护作用，其中涉及的可能机制有：ABCG2作为血脑屏障上的药物转运子，可阻止Aβ1-40进入血脑屏障，从而直接减少Aβ140在小鼠脑内沉积：ABCG2通过减少氧化应激条件下细胞内Aβ前体蛋白APP的酶解，降低参与APP酶解的分泌酶的活性，最终导致细胞分泌Aβ1-40减少。