结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的人、畜、禽共患的慢性传染病，是目前全球重大传染病之一，较难控制且持久。据世界卫生组织统计，其病死率仅次于人类免疫缺陷病毒(HIV)／获得性免疫缺陷综合症(艾滋病，AIDS)，位居第二的传染性疾病。结核的控制由于耐药菌株尤其是耐多药结核菌(MD-RTB)的出现及HIV/AIDS的传播与流行更加困难，其发病率在世界各地呈现回升趋势，并居高不下。据世界卫生组织报道，全球约1/3人口被结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)潜伏感染，在人体免疫力低下时可发展成为活动性结核。潜伏感染的结核分枝杆菌所处的低代谢休眠状态，能逃避机体特异性免疫反应对其的清除，而且活动性结核时不但存在可增殖的细菌，同时也存在休眠菌，这是结核病难于控制和消除的重要原因之一。卡介苗（Bacilli Calmette-Guerin,BCG）对预防儿童脑膜炎结核、栗粒性结核等严重的结核病有预防作用，但对成人肺结核保护效率据文献报道18%到80%不等，对潜伏感染结核几乎无保护作用，因此，研究针对成人结核病和潜伏感染结核病的新型疫苗及其免疫策略迫在眉睫。另外，结核感染过程中，免疫细胞通过产生释放细胞因子调节免疫反应，所以疫苗的设计、评价离不开细胞因子尤其是具有保护作用的细胞因子。γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）是主要的Th1细胞因子，传统认为的唯一的保护性细胞因子；白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）是Th2细胞因子可抑制Th1型免疫反应，从而利于结核分枝杆菌的存活。有研究表明白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）在结核感染中发挥了一定的作用，且有文献对结核病人细胞因子包括IL-17、IFN-γ及IL-4的产生分泌进行了检测。据此，本研究选择结核分枝杆菌对数生长期抗原Ag85B及Mpt64的190-198位的氨基酸多肽（CD8+T细胞表位），以及休眠期的保护性抗原Hsp16.3，构建融合蛋白亚单位疫苗，检测其免疫特性；应用BCG初免-蛋白亚单位疫苗加强免疫策略，比较融合蛋白亚单位疫苗对BCG的强化免疫效应及保护效力；应用实验室构建的新型结核亚单位疫苗检测免疫鼠分泌的IL-17, IFN-γ，并系统评价临床研究中BCG接种婴儿、儿童及结核感染成人IL-17, IFN-γ及IL-4三种细胞因子分泌水平。1.结核病多期抗原亚单位疫苗的构建及免疫特性评价目的：为了构建同时对休眠期细菌和生长期细菌具有保护性免疫应答的结核疫苗，本研究选择结核分枝杆菌休眠期、对数生长期的重要保护性抗原Hsp16.3、Ag85B及Mpt64的190-198位的氨基酸多肽（CD8+T细胞表位），构建融合蛋白Ag85B-Mpt64190-198-Hsp16.3（AMH），并对其免疫特性进行研究。方法：应用PCR扩增Ag85B、Mpt64190-198-Hsp16.3基因，并依次插入pET28a质粒中，在大肠杆菌BL21中诱导表达AMH蛋白，并应用亲和层析法纯化该融合蛋白。将该融合蛋白和复合佐剂二甲基三十六烷基铵及卡介苗多糖核酸(DDA+BCG-PSN）混合构建亚单位疫苗，于0、3、6周分别皮下免疫C57BL/6小鼠三次，第11周检测细胞免疫与体液免疫反应。结果：该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式稳定表达，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化得到蛋白纯度较高；利用该融合蛋白构建的亚单位疫苗免疫动物后，能诱导脾淋巴细胞产生针对结核分枝杆菌抗原（PPD、Ag85B、Mpt64190-198及Hsp16.3）分泌较高水平的IFN-γ，及较高水平的IgG1、IgG2a，IgG2a/IgG1。结论：结核分枝杆菌AMH亚单位疫苗能诱导较强的特异性细胞免疫和体液免疫应答，该融合蛋白有望成为结核亚单位疫苗候选抗原，有进一步研究的必要。2.结核病多期抗原亚单位疫苗对卡介苗免疫及保护效率的加强目的：为了研究结核分枝杆菌多期抗原串联构建的亚单位疫苗加强BCG初始免疫效应及保护效率，以及如何有效的使用此类疫苗，本研究采用包含或不包含休眠期抗原的疫苗，即Ag85B-Mpt64190-198-Hsp16.3(AMH), Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4(AMM)，并将此两种蛋白混合构建疫苗加强卡介苗，观察免疫效应及保护效率。方法：将Ag85B、AMH、AMM以及AMH+AMM蛋白分别与复合佐剂二甲基三十六烷基铵及卡介苗多糖核酸(DDA+BCG-PSN）混合制备亚单位疫苗。第0周用卡介苗皮下免疫C57BL/6小鼠，分别于第8、10周用各亚单位疫苗皮下加强免疫两次，部分小鼠于第14周眼睛采血检测抗体水平，并分离脾淋巴细胞检测分泌IFN-γ的细胞数；其余小鼠末次免疫后12周用H37Rv株经尾静脉攻击，6周后取肺组织进行菌落计数、抗酸杆菌检测，并HE染色进行组织学观察。结果：与BCG组比较，各亚单位疫苗加强小鼠血清Ag85B特异性IgG1、IgG2a抗体滴度明显增高；所有融合蛋白疫苗加强免疫小鼠脾细胞均产生分泌高水平的Ag85B、PPD特异性IFN-γ；所有融合蛋白加强组免疫小鼠肺组织结核结节面积与BCG组差异无统计学意义；只有AMM+AMH加强组免疫小鼠肺组织菌落计数明显低于BCG组，并且其抗酸染色阳性细菌数也显著减少。结论：AMM+AMH疫苗加强BCG，显著清除小鼠肺组织结核分枝杆菌，能诱导特异性的细胞免疫和体液免疫应答，可抑制攻毒后6周小鼠肺组织中结核杆菌的生长，而且病理反应较轻，增强BCG保护效力。3.白细胞介素17的结核免疫作用目的：接种结核疫苗或结核感染时，免疫细胞有赖于细胞因子调节抗结核，新近研究提示Th17细胞产生释放的IL-17在结核进展中的作用不容忽视，为探讨其作用及可能机制，从而寻求疫苗评价指标，本研究应用实验室构建的具有较好保护效应的新型结核亚单位疫苗检测了免疫鼠分泌的IL-17, IFN-γ，并系统评价临床研究中BCG接种婴儿、儿童及结核感染成人IL-17, IFN-γ及IL-4三种细胞因子水平。方法：新型疫苗MH、EAMM在BCG初免后12、14周连续加强免疫C57BL/6小鼠两次，BCG和PBS免疫组为对照，第20周（末次免疫后6周）ELISPOT检测分泌IL-17, IFN-γ的脾细胞数。并应用检索词“白介素17或Th17细胞”和“结核”计算机检索数据库PubMed, EMBASE, Cochrane图书馆、BIOSIS Previews、中国生物医学文献数据库等，检索时间均为建库至2011年12月。全面检索有关人类结核的IL-17及IFN-γ产生量的文献，按照纳入标准筛选文献,由前两位研究者分别提取纳入文献的特征信息（外周血中抗原特异性IL-17及IFN-γ的水平），并分析。结果：BCG初免亚单位疫苗加强组小鼠产生的IFN-γ、IL-17均明显高于BCG单独免疫组。系统评价研究共检出相关文献226篇,按照文献纳入标准,最终纳入9篇文献。3篇文献（116名被研究者）报道了BCG接种后细胞因子水平,表明BCG接种后诱导了极高量的IL-17和IFN-γ。6篇文献（380名被研究者）报道了结核感染后细胞因子水平，表明活动性结核病人IL-17和IFN-γ低而IL-4高；潜伏结核比较活动性结核，IL-17和IFN-γ具有增高的趋势，但IL-4是降低的。结论：动物模型研究表明IL-17和IFN-γ在结核免疫反应中趋势相同。系统评价研究表明在BCG接种后及结核感染时，IL-17和IFN-γ具有一定的保护作用；数据不支持IL-17具有诱导组织损伤的作用。