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目的:通过研究TLRs阻断剂对P.gingivalis诱发HUVECs炎症反应信号转导通路下游信号分子及HUVEC分泌炎性因子的影响,探讨P.gingivalis影响和调节内皮细胞天然免疫和炎症反应的作用机制及信号转导通路,并为As及其相关CVD的防治提供新的思路。
方法:标准条件下厌氧培养ⅣfimA型P.gingivalis(W83),收集菌液提取细菌DNA,克隆ⅣfimA型P.gingivalis(W83)的fimA序列,构建fimA的原核表达系统pET-30a-FimABL21DE3,IPTG诱导表达重组菌毛蛋白rFimA;体外培养HUVECs,待HUVECs单层融合后,分别加入anti-TLR2单克隆抗体和anti-TLR4单克隆抗体孵育30min后,再加入不同浓度的Ⅳ型rFimA,共同培养2h、6h和24h,采用RT-PCR检测TLR信号转导通路接头分子MyD88及HUVECs中致炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α),趋化因子(IL-8和MCP-1),粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)的mRNA表达水平;HC定性分析NF-κB的核移位;ELISA法测定培养上清液中致炎细胞因子和趋化因子的分泌量;FCM检测HUVECs表面粘附分子的蛋白表达量。
结果:1.TLR2阻断剂对ⅣfimA型P.gingivalis-rFimA刺激的HUVECs炎症反应信号转导通路下游信号分子及HUVECs分泌炎性因子的影响:(1)TLR2阻断剂(10ug/ml)预处理HUVECs30min后,不同浓度Ⅳ型rFimA刺激HUVECs表达MyD88mRNA水平在6h10μg/ml组,24h三个实验组低于阳性和阴性对照组,且差异均有统计学意义(P＜0.05);(2)NF-κB在6h和24h与对照组比较其阳性细胞率明显下降(P＜0.05)。(3)IL-1β和IL-6在2h、6h和24h时,三个实验组的mRNA水平和蛋白表达量与阳性和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);TNF-αmRNA水平在2h和6h0.5μg/ml组,24h三个实验组低于阳性和阴性对照组,且差异均有统计学意义(P＜0.05),其分泌的蛋白量与rnRNA水平一致。(4)IL-8mRNA水平在2h和6h0.5μg/ml组、5μg/ml组低于阳性和阴性对照组,且差异均有统计学意义(P＜0.05),其分泌的蛋白量与mRNA水平基本一致;MCP-1mRNA水平在6h和24h0.5μg/ml组低于阳性和阴性对照组(P＜0.05),其分泌的蛋白量与mRNA水平一致。(5)ICAM-1mRNA水平在24h三个实验组均低于阳性和阴性对照组,且差异均有统计学意义(P＜0.05),其蛋白表达量与mRNA水平一致;VCAM-1的mRNA水平在6h0.5μg/ml组和5μg/ml组,24h三个实验组均低于低于阳性和阴性对照组,且差异均有统计学意义(P＜0.05),其蛋白表达量与rnRNA水平基本一致(P＜0.05)。
2.TLR4阻断剂对ⅣfimA型P.gingivalis-rFimA刺激的HUVECs炎症反应信号转导通路下游信号分子及HUVECs分泌炎性因子的影响:(1)TLR4阻断剂(10ug/ml)预处理HUVECs30min后,不同浓度Ⅳ型rFimA刺激HUVECs表达MyD88mRNA水平在2h0.5μg/ml组、5μg/ml组,6h和24h三个实验组均低于阳性和阴性对照组,且差异均有统计学意义(P＜0.05)。(2)NF-κB在6h和24h与对照组比较,其阳性细胞率明显下降(P＜0.05)。(3)IL-1βmRNA水平在2h0.5μg/ml组、5μg/ml组,6h和24h三个实验组均低于阳性和阴性对照组,且差异均有统计学意义(P＜0.05),其蛋白表达量与mRNA水平一致(P＜0.05)。但在6h和24h10μg/ml组与阳性和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。IL-6的mRNA水平在6h0.5μg/ml组,24h三个实验组均低于阳性和阴性对照组,且差异均有统计学意义(P＜0.05),其蛋白表达量与mR.NA水平基本一致(P＜0.05);TNF-αmRNA水平在2h各实验组与阳性和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05),随时间延长,6h和24hTNF-αmRNA水平逐渐上升,其蛋白表达量与mRNA水平一致(P＜0.05)。(4)IL-8mRNA水平在2h三个实验组与阳性和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05),随时间延长,6h和24h三个实验组IL-8mRNA水平逐渐上升,其蛋白表达量与mRNA水平基本一致,但在24h0.5μg/ml组蛋白表达量与阳性和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。MCP-1mRNA水平随时间延长,在2h10μg/ml组,6h5μg/ml组和10μg/ml组,24h三个实验组,IL-8mRNA水平逐渐上升,其蛋白表达量与mRNA水平一致,但在24h0.5μg/ml组蛋白表达量与阳性和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。(5)ICAM-1mRNA水平在2h5μg/ml组和10μg/ml组,6h5μg/ml组和24h三个实验组均高于阳性对照组(P＜0.05),其蛋白表达量与阳性和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。VCAM-1mRNA水平在2h与阳性和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05),随时间延长,6h10μg/ml组,24h5μg/ml组和10μg/ml组VCAM-1mRNA水平逐渐上升,其蛋白表达量与mRNA水平一致。
结论:1.TLR2和TLR4阻断剂均能抑制MyD88介导的ⅣfimA型P.gingivalis-FimA诱导的HUVECs天然免疫信号转导过程,使NF-κB不能激活,无法启动细胞因子基因的转录与翻译,进而抑制HUVECs分泌致炎细胞因子。其中TLR2阻断剂可抑制HUVECs分泌炎症因子TNF-α、趋化因子IL-8和MCP-1以及粘附分子ICAM-1和VCAM-1;TLR4阻断剂可抑制HUvECs分泌炎症因子IL-1β、IL-6。
2.ⅣfimA型P.gingivalis-FimA诱导HUVECs天然免疫反应信号转导通路可能与TLR2和TLR4有关,应用TLR2和TLR4阻断剂可以抑制ⅣfimA型P.gingivalis-FimA刺激的HUVECs炎症反应,推测FimA是P.gingivalis刺激HUVECs炎症反应的重要效应分子之一。