【摘 要】
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目的:本课题旨在探究胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）中的神经保护作用,是否与影响星形胶质细胞神经支持能力和线粒体功能相关,并探究GLP-1的保护作用与cAMP/PKA通路之间的关系。方法:使用Aβ1-42诱导原代Spargue-Dawley（SD）大鼠星形胶质细胞,构建AD细胞损伤模型。使
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目的:本课题旨在探究胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）中的神经保护作用,是否与影响星形胶质细胞神经支持能力和线粒体功能相关,并探究GLP-1的保护作用与cAMP/PKA通路之间的关系。方法:使用Aβ1-42诱导原代Spargue-Dawley（SD）大鼠星形胶质细胞,构建AD细胞损伤模型。使用GLP-1干预Aβ诱导的星形胶质细胞,通过MTT法检测细胞活力,选择GLP-1的最适干预时间和干预浓度。在检测神经支持能力方面,通过酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测星形胶质细胞脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）分泌情况;建立星形胶质细胞-神经元共培养体系,通过免疫荧光法标记β-tubulin检测共培养神经元突触生长情况,并通过Hoechst/PI染色,检测共培养神经元的细胞存活情况。在检测线粒体变化方面,通过Mito Tracker Red荧光探针标记线粒体形态,以及Western Blot法检测线粒体分裂相关蛋白dynamin-related protein 1（DRP1）、线粒体融合相关蛋白mitofusin 2（MFN2）和optic atrophy 1（OPA1）的表达水平,评估线粒体分裂融合状态;通过检测ATP水平、利用细胞能量代谢仪测量细胞的氧消耗速率（oxygen consumption rate,OCR）检测线粒体压力,Mito SOX探针标记线粒体活性氧（reactive oxygen species,ROS）、JC-1探针标记线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）,评估线粒体功能。在GLP-1干预的基础上,进一步应用PKA抑制剂H-89,抑制cAMP/PKA通路,通过ELISA法检测各组星形胶质细胞内的cAMP水平,以及使用Western Blot法检测细胞内的PKA蛋白磷酸化水平,并检测以上神经支持能力和线粒体功能相关指标的改变。结果:（1）成功培养原代SD大鼠星形胶质细胞,使用10μM Aβ1-42干预星形胶质细胞24 h,构建AD细胞模型。（2）100 n M GLP-1可明显改善Aβ诱导的细胞活力降低,改善Aβ诱导的星形胶质细胞神经支持能力损伤和线粒体功能障碍。在神经支持能力方面,GLP-1可促进Aβ诱导的星形胶质细胞分泌BDNF,改善与星形胶质细胞共培养的神经元的生长和存活。在线粒体功能方面,GLP-1可抑制Aβ诱导的星形胶质细胞线粒体碎片化,保护线粒体形态,同时增加抑制性分裂相关蛋白p-DRP1（ser637）和融合相关蛋白MFN2和OPA1的表达水平;GLP-1还可提高ATP水平,增加基础呼吸、最大呼吸、线粒体ATP产量,减轻质子漏情况,降低线粒体ROS生成,增加MMP。（3）GLP-1对Aβ诱导的星形胶质细胞神经支持能力损伤和线粒体功能障碍的改善作用,可能与激活cAMP/PKA通路相关。应用PKA抑制剂H-89阻断cAMP/PKA通路后,GLP-1对Aβ诱导的星形胶质细胞损伤的改善作用被逆转。GLP-1可上调Aβ诱导的星形胶质细胞中cAMP水平和p-PKA蛋白表达水平,而H-89降低了星形胶质细胞p-PKA蛋白表达但对cAMP水平无明显影响,并降低了细胞活力。H-89可逆转GLP-1对神经支持功能的改善作用,表现为星形胶质细胞BDNF分泌减少,共培养神经元生长受限,细胞死亡增加。H-89还逆转了GLP-1对线粒体功能的改善作用,表现为星形胶质细胞线粒体过度分裂,抑制性分裂相关蛋白p-DRP1（ser637）和融合相关蛋白MFN2和OPA1蛋白表达均减少,ATP水平降低,基础呼吸、最大呼吸、线粒体ATP产量减少,质子漏增加,线粒体ROS生成增加以及MMP降低。结论:GLP-1可减轻Aβ诱导的星形胶质细胞线粒体功能障碍,改善其神经支持能力,GLP-1的改善作用可能与激活cAMP/PKA通路相关。
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