REMS剥夺24h影响小鼠空间学习记忆力的年龄相关性及海马NO的机制研究

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快速眼动睡眠(REMS)是睡眠周期中最重要的环节,直接影响到睡眠的质量,而睡眠是机体体力和脑力恢复的关键。随着现代社会的飞速发展,人们的学习工作及生活步伐均明显加快,相比上个世纪的睡眠时间明显缩短1小时左右;睡眠不足的现象在都市人群中尤为严重,而学习记忆力减退、思维敏捷度降低、生长发育迟滞、焦虑情绪明显及免疫力低下等睡眠问题已经严重干扰到人们日常的生活;睡眠健康受到越来越多人的重视,2011年国际精神卫生和神经科学基金会将每年的3月21日定为国际睡眠日,意旨在引起人们对睡眠健康及睡眠质量的关注,2003年中国睡眠研究会将“世界睡眠日”正式引入中国。世界卫生组织的调查显示,全世界约有29%的人存在睡眠问题,中国居民的睡眠问题则高达42.7%;而国内研究机构发现中国居民中6-12岁、13-17岁、18-44岁、45-59岁和60岁以上的睡眠不足比例分别是69%、58%、4.1%、9.2%和17.1%,青少年睡眠不足现象比较严重;而中国妇联的一项调查更令人关注,中国各个年龄段青少年的睡眠时间均未达到国家规定(小学生每日睡眠10小时,初中生9小时,高中生8小时),其身体发育可能受到影响。青少年是国家发展的未来,应当重视青少年睡眠问题,而相关青少年睡眠不足的研究尤为迫切。  一氧化氮(NO)是目前机体最小的气态生物信使分子;美国科学家Furchgott在1980年的研究中发现了这种小分子物质,发现它具有松弛血管平滑肌的作用,是一种活跃的生物自由基,当时被命名为血管内皮细胞舒张因子(EDRF),而后 EDRF被确认是 NO;它广泛的分布于各组织内,特别是神经组织中,NO作为重要的神经递质,参与脑内许多生理机能调节,而作为逆行性反馈的神经信号分子,参与了海马LTP和学习记忆形成过程,其中海马LTP被认为是学习记忆形成的主要神经生理机制之一;当海马 NO缺乏时会影响LTP,继而造成异常的学习记忆形成,诸多的实验也证明 NO在学习记忆中的重要作用。  动物的 REMS剥夺模型表现的症状能较好的反映出人类睡眠不足所产生的变化,有实验表明成年期动物在REMS剥夺48h后开始出现学习记忆力下降及相关脑区NO水平降低,而REMS剥夺24h未见明显改变;那么青少年期动物和成年动物表现是否一致的问题,未见相关报道。青少年期是生长发育关键期,可能比成年期更易受到影响,为了进一步了解REMS剥夺对青少年期动物的学习记忆力和脑区NO水平影响,选择REMS剥夺24h作为时间点进行改良的水迷宫实验来测定学习记忆力,选择与学习记忆力相关度最高的海马作为NO水平测定的脑区。可以通过实验了解动物青少年期发育脑与成年期成熟脑在REMS剥夺作用下的行为及海马NO水平差别,为进一步研究不同年龄间REMS剥夺影响学习记忆的机制提供基础支持。  第一部分青少年期和成年期小鼠REMS剥夺24h后对学习记忆力及海马NO的影响差异  【目的】观察青少年期和成年期小鼠REMS剥夺24h后对学习记忆力和NO的影响差异,通过改良的水迷宫实验测定其学习记忆力、亚硝酸盐滴定法间接测定海马组织NO水平。探讨青少年期和成年期之间REMS、NO和学习记忆力的关系。  【方法】成年期(8-12周龄)C57BL/6J小鼠45只,重量约20g;青少年期(3-4周龄)C57BL/6J小鼠45只,重量约10g;成年期和青少年期的小鼠各自随机分为REM睡眠剥夺(REM-SD)组、大平台(WP)组、正常对照(NC)组,每组15只并分笼标记。REM-SD组通过改良多平台水环境法(MMPM)制作C57BL/6J小鼠REMS剥夺24h模型,WP组通过大水平台法制作C57BL/6J小鼠REMS假剥夺24h模型,NC组无任何处理仍在鼠笼中饲养;利用水迷宫改良实验在当天测定其各组的空间学习记忆力并进行数据统计分析,最后分离出小鼠海马组织并通过亚硝酸盐滴定法测定出各组海马NO水平。了解青少年期与成年期之间REMS剥夺24h对学习记忆力和NO水平的影响差别。  【结果】在空间学习阶段,青少年期和成年期小鼠寻找隐藏平台的逃避潜伏期随着训练轮数的增多而减少。在青少年期第1、2、3轮训练的各组逃避潜伏期依次递减。在青少年期第1、2、3轮学习中,通过LEP的两两比较,REM-SD组比NC组和WP组的逃避潜伏期显著性减少,而WP组与NC组逃避潜伏期无显著性差异。在成年期各组间,第1、2、3轮学习阶段的逃避潜伏期未见显著性差异。在空间记忆阶段,青少年期和成年期小鼠各组间的靶象限距离和时间百分比均未见显著性差异,其中青少年期REM-SD组与NC组、REM-SD组与WP组的穿越平台次数显著性增多,NC与WP组穿越平台次数未见显著性差异;而成年期距离百分比、时间百分比和穿越平台次数减少,但无显著性差异。海马NO检测结果显示青少年期的海马体中,REM-SD组分别与NC组和WP组比较显示亚硝酸盐水平是显著性增高,NC组与WP组的亚硝酸盐水平均未见显著性差异。成年期的海马体中,各组间亚硝酸盐水平未见显著性差异。  【结论】相对于成年期小鼠,青少年期REMS剥夺24h后学习记忆力出现明显改变,可能与海马NO水平升高有关,说明小鼠大脑在青少年期比成年期的稳定性差,更易受外界刺激而出现机体生理及心理上的改变。  第二部分青少年期和成年期小鼠注射7-NI后对学习记忆力的影响差别  【目的】观察青少年期和成年期小鼠在腹腔注射7-NI后对学习记忆力的影响差别,通过经典水迷宫实验检测小鼠学习记忆力、亚硝酸盐滴定法间接测定海马组织NO水平,探讨NO参与学习记忆力的机制。  【方法】成年期(8-12周龄)C57BL/6J小鼠30只,重量约20g;青少年期(3-4周龄)C57BL/6J小鼠30只,重量约10g;成年期和青少年期的小鼠各自随机分为7-吲哚乙酸抑制(7-NI)组和空白对照(NC)组,每组15只并分笼标记。7-NI组通过5天连续腹腔注射神经元型一氧化氮合酶(nNOS)抑制剂7-NI制作7-NI药物模型,NC组5天连续腹腔注射食用植物油溶剂;利用经典MWM实验测定各组小鼠学习记忆力,然后将小鼠颈椎脱臼处死后提取海马组织,利用亚硝酸盐滴定法间接测定各组小鼠海马组织的NO水平,了解青少年期和成年期小鼠注射7-NI后对学习记忆力的影响是否有差别。  【结果】在空间学习阶段,青少年期和成年期小鼠寻找隐藏平台的逃避潜伏期随着训练轮数的增多而减少。在青少年期的两组间,第1、2、3、4天学习阶段的逃避潜伏期未见显著性差异。在成年期第3、4天学习中,通过配对样本T检验的两两比较,7-NI组比NC组的逃避潜伏期显著性升高。在空间记忆阶段,青少年期和成年期小鼠各组间的穿越平台次数均未见显著性差异,其中青少年期7-NI组与NC组的靶象限距离和时间百分比均出现显著性差异,而成年期距离百分比和时间百分比虽然减少,但无显著性差异。亚硝酸盐滴定法测定7-NI组小鼠海马NO水平在青少年期和成年期均出现下降,但只有成年期有统计学意义。  【结论】7-NI抑制nNOS活性后,海马NO水平下降,青少年期小鼠出现记忆能力降低,而成年期小鼠出现学习能力降低,说明海马NO水平是调控学习记忆力的重要因素,在不同年龄段,海马NO水平的改变对学习记忆有不同影响。
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