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能量是生物体进行各项正常生命活动的基础,而糖类则是生命活动所需能量的主要来源,理论上减弱或阻断糖类代谢可以治疗一些与糖代谢有关的疾病或者达到杀生的效果。生物体的糖代谢过程包括葡萄糖转化为非糖物质并释放能量的糖酵解途径以及非糖物质转化为葡萄糖的糖异生途径。糖异生是人体内源性葡萄糖产生的主要途径之一,是Ⅱ型糖尿病病人体内空腹高血糖升高的主要原因。人体肝脏果糖-1,6-二磷酸酶(简称Hu-FBPase)是糖异生途径中重要的调控酶,抑制Hu-FBPase的活性,可以抑制糖异生途径、降低肝细胞葡萄糖释放量,是治疗Ⅱ型糖尿病的新型潜在靶标。Hu-FBPase是由四个的单体组成的同源四聚体,每个单体中含有一个果糖-1,6-二磷酸(简称FBP)结合的底物位点和一个单磷酸腺苷(简称AMP)结合的变构位点。现有的Hu-FBPase抑制剂多是针对AMP变构位点设计而得到的,而人体中的AMP是细胞内能量状态的重要生理学传感器,调控着多种靶酶,针对AMP变构位点的抑制剂可能会具有选择性不良的缺点,而导致副作用较大。本文成功的对Hu-FBPase进行了异源表达、纯化,建立了 Hu-FBPase酶体抑制剂筛选体系,并以Hu-FBPase底物位点为靶点采用高通量虚拟筛选技术筛选得到多个全新结构类型的Hu-FBPase抑制剂,XY5(IC50= 17.1 μM)、XY8(IC50 =15.8 μM)、XY23(IC50= 8.3 μM)。另从FBP和AMP结构特点出发从头设计了一类硝基苯乙烯类Hu-FBPase抑制剂,其中HS39对Hu-FBPase的抑制常数IC50值达到0.13 μM;化合物HS14不仅对Hu-FBPase有较好的抑制效果(IC50= 0.89 μM),而且100 μM时对小鼠肝细胞葡萄糖释放量有明显的抑制作用,其抑制效果和商品化药物二甲双胍2 mM的抑制效果相近。抑制剂与靶酶的作用方式研究是阐述抑制剂作用机制、设计更高活性抑制剂的基础。Hu-FBPase 每个单体中含有一个底物位点和一个变构位点,判断 Hu-FBPase 抑制剂结合位点是研究抑制剂与Hu-FBPase作用方式的前提。本文建立了一种新的利用TNP-AMP荧光探针分子判别Hu-FBPase抑制剂结合位点的快速检测方法,并通过此方法判断了硝基苯乙烯类化合物HS49是同时结合于Hu-FBPase底物和变构两个位点的。另外也通过分子对接与定点突变相结合的实验方法研究了硝基苯乙烯类化合物HS12在Hu-FBPase底物位点和变构位点可能的结合模式。研究发现底物位点的K274、Y264、N212、Y244、R243、S124和变构位点的T27突变后对HS12的抑制活性均有不同程度的影响,HS12对相关突变体的抑制活性下降1.9-45倍。以上实验结果说明这些氨基酸是HS12在底物位点和变构位点有重要相互作用的氨基酸残基。发现新靶标,设计新结构、新作用方式的新型抑制剂一直是抗真菌药物研究的重点和难点,以糖代谢途径中Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(简称FBA-Ⅱ)为靶标的抑制剂研究或许能为上述问题的解决提供一些新的思路。FBA-Ⅱ同时参与糖酵解和糖异生过程,可逆催化FBP裂解成3-磷酸甘油醛和二羟丙酮磷酸,抑制FBA-II的活性可以阻断整个糖代谢过程,进而导致物种的死亡。现阶段相关物种FBA-II已经有了部分抑制剂的报道,但这些抑制剂多是结构单一、含有磷酸根的底物类似物,这些化合物虽然在酶体上有了较好抑制效果,但均未对菌体生长表现出抑制活性。蓝藻是单细胞的原核生物,结构简单,是相关研究的理想模式生物。本文以蓝藻FBA-II(简称Cy-FBA-II)为研究对象论证了以Cy-FBA-II为靶标设计相关新型杀藻剂的可行性。以Cy-FBA-II为靶标,针对SPECS数据库经过高通量虚拟筛选得到化合物H1(IC50=17.8 μM),参考H1的结构信息及其与Cy-FBA-Ⅱ的结合模式设计得到了化合物1,并合成了一系列化合物1类似物马来酰亚胺类衍生物,测试了其对Cy-FBA-II和Synechocystis sp.PCC 6803的抑制活性,并综合运用分子对接、ONIOM计算、分子动力学、3D-QSAR策略分析了马来酰亚胺类衍生物与Cy-FBA-Ⅱ的结合模式。研究结果表明化合物10不仅对Cy-FBA-Ⅱ表现出较好的抑制活性(IC50 = 1.7 μM),而且对Synechocystp.PCC 6803藻体生长也有较好抑制效果(EC50 = 0.6 ppm)。通过比较化合物10对野生型及Cy-FBA-II过量表达的转基因Synechooystis sp.PCC 6803的抑制活性,初步证明了此类马来酰亚胺衍生物确实是通过抑制Synechocystis sp.PCC 6803体内Cy-FBA-Ⅱ活性而达到抑制藻体生长的。相应的酶体及藻体实验结果表明Cy-FBA-Ⅱ可以成为设计、合成、发展新型杀藻剂的潜在靶标。Cy-FBA-Ⅱ可以作为新型靶标设计相关杀藻剂,一定程度上也说明了针对其他物种的FBA-Ⅱ设计相关抑制剂也是有可能的。我们以常见致病菌、模式真菌C.albicans FBA-Ⅱ为研究对象开展了相关抑制剂设计的研究工作。本文成功的对Ca-FBA-Ⅱ进行了异源表达、纯化并建立了 Ca-FBA-Ⅱ酶体抑制剂筛选体系;以E.coli FBA-Ⅱ晶体结构(PDB:1B57)为模板,使用SWISS-MIDEL同源模建了 Ca-FBA-Ⅱ的3D结构并其合理性进行了评价;以Ca-FBA-Ⅱ为靶标,针对SPECS数据库经过高通量虚拟筛选得到化合物FBA1(IC50 = 16.5 μM),并合成了一系列FAB1类似物苯肼亚基戊二酮类化合物,确定了苯肼亚基戊二酮类化合物的药效团模型;参考上述药效团模型、FBA1的结构信息及其与Ca-FBA-Ⅱ的结合模式,由FBA1出发设计了化合物ZY1和ZY15,并合成了一系列ZY1类似物苯腙类衍生物,其中化合物ZY1、ZY15 对 Ca-FBA-Ⅱ的 IC50 值分别为 2.7 μM 和 0.96 μM,化合物 ZY2 对 C.albicans(MIC80 =16 μg/mL)、C.glabrata(MIC80= 2 μg/mL)、C.tropicalis(MIC80= 32 μg/mL)三种真菌生长具有一定抑制效果。另外此类苯腙类抑制剂与氟康唑联合使用时对耐药白色念珠菌100和103菌表现出明显的协同抑制活性,其中ZY1和氟康唑(16 μg/mL)联合用药时两者对耐药白念珠菌100菌MIC80= 0.5 μg/mL,FICI = 0.012(当FICI≤0.5,两药的相互作用确定为协同作用),对耐药白念珠菌100菌MIC80=0.25μg/mL,FICI= 0.003。初步得到一类非底物类似物且对菌体生长有一定抑制效果的Ca-FBA-II抑制剂。综上所述,本文以糖代谢途径中的FBPase和FBA-Ⅱ为靶标,综合运用多种学科方法,采用理论计算与实验相结合的研究思路,合理设计了几类全新结构类型对Hu-FBPase、Cy-FBA-Ⅱ和Ca-FBA-Ⅱ有较好抑制活性的抑制剂。以上研究工作为治疗Ⅱ型糖尿病、开发新型杀菌剂、杀藻剂提供了新的思路和一定的研究基础。