固有免疫,又称为天然免疫,是机体抗感染和抗肿瘤的“第一道防线”;通过多种模式识别受体介导的信号通路而激活。NLRP3炎症小体是由模式识别受体NLRP3、接头蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)组成的多聚蛋白复合体,感受来自病原微生物的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)以及细胞自身释放的损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern molecules,DAMPs),在人体多种生理、病理进程中发挥重要作用。NLRP3炎症小体活化失衡将导致多种疾病的发生,如感染性疾病、痛风、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病及癌症等。因此,揭示NLRP3的表达调控机制,对于阐明NLRP3炎症小体相关疾病发生、发展的机理,寻找免疫调节治疗的新途径具有重要意义。近年来,表观遗传调控越来越多的被发现参与固有免疫和炎症反应的调控。组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传修饰,可调控生理和病理过程中多种信号通路的活化。表观遗传修饰中组蛋白甲基化修饰主要发生在机体组蛋白H3或H4的赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R)残基上,起到基因调节的目的。H3K9me3(H3第9位赖氨酸(H3K9)的三甲基化修饰)和H3K27me3(第27位赖氨酸(H3K27)的三甲基化修饰),被认为是转录抑制的异染色质的标志[1];而H3K9me3和H3K27me3的去甲基化是基因表达所必需的。已有报道,组蛋白去甲基化酶JMJD3的抑制剂通过去除H3K27me3的去甲基化酶活性抑制人原代巨噬细胞中促炎基因的激活,进而抑制炎性细胞因子TNF-α的分泌[2]。因此,组蛋白的甲基化修饰对炎症反应的动态调控可能是炎症相关疾病的潜在治疗方法。然而,H3K9的去甲基化在炎症和固有免疫反应中的作用,尚不清楚。组蛋白去甲基化酶KDM4B(lysinedemethylase 4),又称为JMJD2B,可特异性去除H3K9甲基化修饰。KDM4B可通过其组蛋白去甲基化酶活性参与多个生理和病理过程的调控。比如,KDM4B通过调控靶基因的H3K9去甲基化促进乳腺癌发生[3].通过结合AR(雄激素受体)促进前列腺癌的进展[31]。因此,我们推测KDM4B是否通过其去甲基化酶活性调控组蛋白H3甲基化状态,调控固有免疫和炎症反应?因此,我们重点研究了组蛋白去甲基化酶KDM4B对炎症反应的调控,特别是KDM4B对NLRP3炎症小体的调控效应和分子机制。本研究旨在通过阐明NLRP3在转录水平的分子调控机制,从表观遗传调控的角度揭示NLRP3炎症小体的活化调控机制,为NLRP3炎症小体活化异常所引发的机体相关疾病的治疗提供新的靶点。材料和方法1.KDM4特异性抑制剂ML324对NLRP3炎症小体活化及NLRP3表达的影响1.1用DMSO和KDM4特异性抑制剂ML324(20mM)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞 2h,再用 LPS(200 ng/ml)刺激 6-7h,进而用 ATP(5mM),Nig(50μM)和poly(dA:dT)(200ng/ml)刺激45～60min,收集细胞培养上清。ELISA检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平变化。1.2用不同剂量的ML324(5mM,10mM,20mM,50mM)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h,再用LPS(200 ng/ml)刺激6-7h,然后用ATP刺激45～60min,收集细胞培养上清。ELISA检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平变化。1.3用DMSO和ML324(20mM)处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h后,用LPS(200ng/ml)刺激不同的时间点(0h,4h,8h),再用ATP刺激45～60min。收集腹腔巨噬细胞细胞培养上清和腹腔巨噬细胞裂解液,超滤浓缩管将细胞上清进行浓缩,Western blot检测细胞培养上清中Caspase-1 p20/p10、IL-1β p17的分泌,以及细胞裂解液中 Caspase-1 p45、IL-1βp31、NLRP3、ASC、AIM2、NLRC4 等的表达情况。1.4用不同剂量的ML324(5mM,10mM,20mM,50mM)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h后,再用LPS(200 ng/ml)刺激6-7h,再分别用ATP刺激45min～60min,收集细胞培养上清和细胞裂解液,超滤浓缩管将细胞上清进行浓缩,,Western blot检测细胞培养上清中Caspase-1 p20/p10、IL-1β p17的分泌,以及细胞裂解液中Caspase-1 p45、IL-1βp31、NLRP3、ASC、AIM2、NLRC4 等的表达情况。1.5分别用DMSO和ML324(20mM)处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h,再用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间(0,4h,8h),Western blot检测细胞裂解液中炎症小体相关组分的蛋白水平表达变化。1.6分别用DMSO和ML324(20mM)处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h,再用LPS(200 ng/ml)刺激(0,2h)后,提取 RNA 反转录成 cDNA,RT-PCR 检测 IL-1β、IL-6、TNF-α和NLRP3在mRNA水平的表达变化。1.7用不同剂量的ML324(5mM,10mM,20mM,50mM)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h,再用LPS(200 ng/ml)刺激(0,2h)后,提取RNA反转录成cDNA,RT-PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α和NLRP3在mRNA水平的表达变化趋势。2.KDM4B对NLRP3表达的影响2.1 使用脂质体 lipo2000 将 KDM4A-Flag、KDM4B-Flag、KDM4C-Flag、KDM4D-Flag质粒以及其空载pcmv-Flag质粒分别转入293T细胞中,24h后裂解细胞,Western blot检测KDM4家族成员对NLRP3蛋白水平的影响。2.2设计合成KDM4B特异性的小干扰RNA一组,用转染试剂INTERFERIN(?)将靶向KDM4B的小干扰RNA-KDM4B-siRNA以及相应的对照Ctrl-siRNA转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并连续培养48h后裂解细胞,Western blot检测细胞裂解液中KDM4B的蛋白表达情况,明确设计合成的KDM4B-siRNA的最佳干扰效率,筛选出所合成的KDM4B特异性的小干扰RNA中抑制效率最佳的干扰片段,为接下来的实验做准备。2.3用转染试剂INTERFERIN(?)Ctrl-siRNA和2.2中筛选出的抑制效率高的KDM4B-siRNA分别转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,继续培养小鼠腹腔原代巨噬细胞48h,用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间点(0,4h,8h),收集裂解腹腔原代巨噬细胞,通过Western blot检测NLRP3炎症小体组成成分在蛋白水平的表达情况。2.4用转染试剂INTERFERIN(?)将Ctrl-siRNA和2.2中筛选出的抑制效率高的KDM4B-siRNA分别转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养48h,用LPS(200 ng/ml)刺激(0,h)后,提取RNA反转录成cDNA后,通过RT-PCR检测小鼠腹腔原代巨噬细胞NLRP3炎症小体相关组分在mRNA水平的表达情况。2.5取野生型C57 BL/6小鼠(KDM4B+/+)和CAS9技术构建的全身性敲除KDM4B的C57 BL/6小鼠(KDM4B-/-)腹腔原代巨噬细胞,待细胞贴壁后,用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间(0,4h,8h),Western blot检测细胞裂解液中NLRP3炎症小体相关组分在蛋白水平的表达情况。2.6取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,待细胞贴壁后,用LPS(200 ng/ml)刺激(0,2h)后,提取RNA反转录成cDNA后,RT-PCR检测巨噬细胞中NLRP3炎症小体相关组分在mRNA水平的表达情况。3.KDM4B调控NLRP3表达的机制3.1 使用脂质体 lipo2000 将 KDM4B-Flag 和 KDM4B(H189A)-Flag 的质粒分别转入293T细胞中,24h后提取RNA反转录成cDNA后,通过RT-PCR检测两种质粒对NLRP3 mRNA水平的影响。3.2取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间点(Oh,1h,4h),再使用RNA聚合酶Ⅱ(polymerase Ⅱ,pol Ⅱ)特异性抗体进行CHIP-qPCR实验,检测KDM4B是否影响pol Ⅱ结合NLRP3基因启动子区。3.3取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间点(0h,1h,4h)后,使用KDM4B特异性抗体进行CHIP-qPCR实验,检测KDM4B是否结合NLRP3基因启动子区。4.KDM4B对NLRP3炎症小体活化的影响4.1用转染试剂INTERFERIN(?)将Ctrl-siRNA和2.2中筛选出的抑制效率高的KDM4B-siRNA分别转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养48h,再用LPS(200 ng/ml)刺激 6h,再分别用 ATP(5mM),Nig(50μM)和 poly(dA:dT)(200ng/ml)刺激45～60min。收集细胞培养上清,用ELISA检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌情况。4.2用转染试剂INTERFERIN(?)将Ctrl-siRNA和2.2中筛选出的抑制效率高的KDM4B-siRNA分别转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养48h,再用LPS(200ng/ml)刺激不同时间(0,4h,8h)后,用ATP刺激45～60min,收集腹腔巨噬细胞培养上清和腹腔巨噬细胞裂解液,超滤浓缩管将上清进行浓缩,Western blot检测细胞培养上清中Caspase-1 p20/p10、IL-1β p17的分泌,以及细胞裂解液中Caspase-1 p45、IL-1βp31、NLRP3、ASC、AIM2、NLRC4 等的表达情况。4.3取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,待细胞贴壁后,用LPS(200 ng/ml)刺激 6h,再分别用 ATP(5mM),Nig(50μM)和 poly(dA:dT)(200ng/ml)刺激45～60min。收集腹腔巨噬细胞培养上清,ELISA检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌情况。4.4取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,待细胞贴壁后,用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间(0,4h,8h),再用ATP刺激45～60min。收集腹腔巨噬细胞裂解液和腹腔巨噬细胞培养上清,用超滤浓缩管将腹腔巨噬细胞上清进行浓缩。Western blot检测细胞培养上清中Caspase-1 p20/p10、IL-1β p17的分泌,以及细胞裂解液中 Caspase-1 p45、IL-1βp31、NLRP3、ASC、AIM2、NLRC4 等的表达情况。4.5用KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,以及KDM4B-siRNA和Ctrl-siRNA转染48h后的小鼠腹腔原代巨噬细胞,设计两组实验分别用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间(0,30min,60min),Western blot检测细胞裂解液中NLRP3炎症小体启动过程相关蛋白在蛋白水平的表达变化。5.体内实验研究ML324对小鼠的影响5.1体内实验---研究ML-324在LPS诱导的脓毒血症中的作用6-8周的C57BL/6小鼠(出生天数一致、体重均一)分别腹腔注射DMSO和ML324(40mg/kg),作用3h后,分对照组和实验组分别腹腔注射PBS(1ml/只)和LPS(10mg/kg)。2h内,摘除眼球静脉取血,用ELISA方法检测外周血血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌情况。5.2体内实验---研究ML324在Alum诱导的小鼠腹膜炎中的作用6-8周的C57BL/6小鼠(出生天数一致、体重均一)分别腹腔注射DMSO和ML324(40mg/kg),作用3h后,分对照组和实验组分别腹腔注射PBS(1ml/只)和Alum(700μg),16h后收集小鼠腹腔灌洗液。小鼠腹腔灌洗液预处理后上流式细胞仪计数,统计分析每只小鼠腹腔渗出细胞的总数,中性粒细胞的数,以及Ly6C+单核细胞的数。研究结果1.ML324对NLRP3炎症小体及NLRP3表达的影响1.1 ML324选择性抑制NLRP3炎症小体活化分别用DMSO和ML324(20mM)处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h,再用LPS(200 ng/ml)刺激 6h,分别用 ATP(5mM)、Nig(50μM)和 poly(dA:dT)(200ng/ml)刺激45～60min,收集细胞培养上清。ELISA检测细胞培养上清发现:ML324处理以后,ATP和Nig诱导的IL-1β分泌降低,IL-6和TNF-α分泌水平不变;而ML324处理不影响poly(dA:dT)诱导的IL-1β分泌。以上结果说明,ML324选择性抑制NLRP3炎症小体活化,对AIM2炎症小体活化没有影响。用不同剂量的ML324(5mM,10mM,20mM,50mM)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h,再用LPS(200 ng/ml)刺激6h,然后用ATP刺激45～60min,收集腹腔巨噬细胞培养上清。ELISA检测细胞因子水平:IL-1β分泌情况发现:IL-1β分泌随ML324浓度的增加而逐渐降低。1.2 ML324 抑制 Caspase-1 剪切用DMSO和ML324(20mM)处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h后,用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间点(0h,4h,8h),再用ATP刺激45～60min。收集细胞培养上清和细胞裂解液,用超滤浓缩管将细胞上清浓缩后,Western blot检测细胞培养上清中Caspase-1剪切(p10和p20的分泌)发现ML324处理后,p10、p20分泌减少,细胞裂解液中Caspase-1表达水平无变化。用不同剂量的ML324(5mM,10mM,20mM,50mM)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h后,再用LPS(200 ng/ml)刺激8h,再分别用ATP刺激45min～60min,收集细胞培养上清和细胞裂解液,超滤浓缩管将上清进行浓缩后,Western blot检测腹腔巨噬细胞培养上清发现Caspase-1剪切(p10和p20的分泌),随ML324浓度的增加而降低,而腹腔巨噬细胞裂解液中Caspase-1表达水平无变化。1.3 ML324特异性抑制NLRP3表达分别用DMSO和ML324(20mM)处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h,再用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间(0,4h,8h),Western blot检测发现:ML324处理后,细胞裂解液中NLRP3蛋白水平降低,而AIM2、NLRC4、ASC和Caspase-1的蛋白水平无变化。分别用DMSO和ML324(20mM)处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h,再用LPS(200 ng/ml)刺激2h,提取RNA反转录成cDNA,RT-PCR检测发现:ML324处理后,NLRP3在mRNA水平的表达降低,而IL-1β、IL-6、TNF-α在mRNA水平的表达无变化。不同剂量的ML324(5mM,10mM,20mM,50mM)分别处理小鼠腹腔原代巨噬细胞2h,再用LPS(200ng/ml)刺激2h,提取RNA反转录成cDNA,RT-PCR检测发现:ML324处理后,NLRP3的mRNA水平随ML324浓度的增加而表达降低。综上表明:ML324剂量依赖性抑制NLRP3mRNA和蛋白水平的表达;且对NLRP3炎症小体其他组分ASC和Caspase-1的表达没有明显影响,不影响其他炎症小体关键分子AIM2和NLRC4的表达。2.KDM4B促进NLRP3 表达2.1KDM4B促进NLRP3表达,KDM4家族其他分子KDM4A/C/D均不影响NLRP3表达使用脂质体 lipo2000 分别将 KDM4A-Flag、KDM4B-Flag、KDM4C-Flag、KDM4D-Flag质粒以及其空载pcmv-Flag质粒分别转入293T细胞中,24h后裂解细胞;Westernblot检测发现KDM4B增强NLRP3蛋白水平的表达,KDM4家族其他分子KDM4A、KDM4C和KDM4D均不影响NLRP3表达。2.3 KDM4B干扰抑制NLRP3表达设计合成KDM4B特异性的小干扰RNA一组,用转染试剂INTERFERIN(?)将靶向KDM4B的小干扰RNA-KDM4B-siRNA以及相应的对照Ctrl-siRNA转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并连续培养48h后裂解细胞,Western blot检测腹腔巨噬细胞裂解液中相关蛋白表达情况,筛选出抑制效率最佳的干扰片段。用转染试剂INTERFERIN(?)将以上筛选出的抑制效率高的KDM4B-siRNA和Ctrl-siRNA转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养腹腔巨噬细胞48h,LPS(200ng/ml)刺激不同的时间点(0,4h,8h),收集裂解细胞,通过Western blot检测细胞裂解液中NLRP3炎症小体相关组分在蛋白水平的表达情况发现:转染KDM4B-siRNA后,明显抑制NLRP3的表达,但对ASC和Caspase-1的表达没有影响。用转染试剂INTERFERIN(?)将以上筛选出的抑制效率高的KDM4B-siRNA和Ctrl-siRNA转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,并继续培养48h,LPS(200 ng/ml)刺激(0,2h),提取RNA反转录成cDNA后,通过RT-PCR检测NLRP3炎症小体相关组分发现:转染KDM4B-siRNA后,NLRP3的mRNA水平表达降低,而IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平的表达无变化。2.4 KDM4B基因敲除抑制NLRP3表达取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,待细胞贴壁后,用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间(0,4h,8h),Western blot检测细胞裂解液中NLRP3炎症小体相关组分在蛋白水平的表达变化发现:KDM4B敲除后,即:KDM4B-/-小鼠腹腔原代巨噬细胞的NLRP3的蛋白表达水平明显降低,而ASC和Caspase-1在蛋白水平的表达无变化。取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,待细胞贴壁后,用LPS(200 ng/ml)刺激2h后,提取RNA反转录成cDNA后,通过RT-PCR检测NLRP3和IL-1β在mRNA水平的表达情况发现:KDM4B敲除后,NLRP3在mRNA的表达水平降低,而IL-1β的mRNA水平的表达无变化2.5 KDM4B干扰和敲除均不影响LPS诱导的NF-κB活化用KDM4B+/+和KDM4B-/-的腹腔原代巨噬细胞,以及KDM4B-siRNA和Ctrl-siRNA转染48h后的小鼠腹腔原代巨噬细胞,设计两组实验分别用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间(0,30min,60min),Western blot检测发现KDM4B干扰或敲除不影响细胞裂解液中LPS诱导的p-IκBα表达。3.KDM4B增强NLRP3转录3.1 KDM4B通过其去甲基化酶活性增强NLRP3表达根据KDM4B酶活性位点构建KDM4B的酶活性突变体KDM4B(H189A)即KDM4B第189位的组氨酸(H)突变为丙氨酸(A),使用脂质体lipo2000将KDM4B-Flag质粒和KDM4B(H189A)-Flag的质粒分别转入293T细胞中,24h后提取RNA反转录成cDNA后,通过RT-PCR检测两种质粒对NLRP3 mRNA水平的影响发现:KDM4B可以增强NLRP3mRNA水平表达,其酶活性突变后,KDM4B促进NLRP3 mRNA水平表达的作用消失。3.2 KDM4B促进RNA聚合酶Ⅱ(polymerase Ⅱ,pol Ⅱ)结合NLRP3基因启动子区取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,用LPS(200ng/ml)刺激不同的时间点(0h,1h,4h),再使用RNA聚合酶Ⅱ(polymerase Ⅱ,pol Ⅱ)特异性抗体进行CHIP-qPCR实验,发现KDM4B+/+腹腔原代巨噬细胞的NLRP3基因启动子区与RNA聚合酶Ⅱ(polymerase Ⅱ,pol Ⅱ)结合增加;说明KDM4B增强pol Ⅱ结合NLRP3基因启动子区,促进NLRP3的转录起始。3.3 KDM4B结合NLRP3基因启动子区取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,用LPS(200ng/ml)刺激不同的时间点(0h,1h,4h),再使用KDM4B特异性抗体进行CHIP-qPCR实验,发现KDM4B与NLRP3基因启动子区结合。4.KDM4B增强NLRP3炎症小体活化4.1 KDM4B干扰抑制NLRP3炎症小体活化诱导的IL-1β分泌和Caspase1剪切用转染试剂INTERFERIN(?)将以上筛选出的抑制效率高的KDM4B-siRNA或Ctrl-siRNA分别转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,培养48h后,用LPS(200 ng/ml)刺激 6h,再分别用 ATP(5mM)、Nig(50μM)和 poly(dA:dT)(200ng/ml)刺激 45～60min。收集细胞培养上清,ELISA检测细胞培养上清中IL-1β、IL-1β,IL-6和TNF-α的分泌情况发现:KDM4B-siRNA处理后,ATP、Nig刺激下细胞培养上清中IL-1β下调、IL-6和TNF-α无明显变化,而KDM4B-siRNA处理后,poly(dA:dT)刺激下细胞培养上清中IL-1β水平不变。用转染试剂INTERFERIN(?)将以上筛选出的抑制效率高的KDM4B-siRNA或Ctrl-siRNA分别转染入小鼠腹腔原代巨噬细胞,培养48h后用LPS(200 ng/ml)刺激不同时间(0,4h,8h),再用ATP刺激45～60min。收集细胞培养上清和细胞裂解液,用超滤浓缩管将上清浓缩。Western blot检测细胞培养上清液中Caspase-1剪切(p10和p20的分泌)情况,以及细胞裂解液中Caspase-1和NLRP3的蛋白表达情况。发现:KDM4B-siRNA处理以后,细胞培养上清液中Caspase-1p10/p20的分泌降低,细胞裂解液中NLRP3的蛋白表达水平降低,而Caspase-1蛋白水平不变。4.2 KDM4B敲除后抑制NLRP3炎症小体活化诱导的IL-1β分泌和Caspase1剪切取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,待细胞贴壁后,用LPS(200 ng/ml)刺激 6h,再分别用 ATP(5mM))、Nig(50μM)和 poly(dA:dT)(200ng/ml)刺激45～60min。收集细胞培养上清,应用ELISA检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌情况发现:KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞中,ATP、Nig刺激下细胞培养上清中IL-1β下调、IL-6和TNF-α无变化,而KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞中,poly(dA:dT)刺激下细胞培养上清中IL-1β水平不变。取KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,待细胞贴壁后,用LPS刺激不同的时间(0h,4h,8h),再用ATP刺激45～60min。收集腹腔巨噬细胞培养上清和腹腔巨噬细胞裂解液,用超滤浓缩管将腹腔巨噬细胞上清浓缩。Westernblot检测细胞培养上清液中Caspase-1 p10/p20的分泌,以及细胞裂解液中Caspase-1和NLRP3的蛋白表达情况发现:全身性敲除KDM4B的C57 BL/6小鼠(KDM4B-/-)腹腔原代巨噬细胞中,上清液中p10/p20的分泌降低,细胞裂解液中Caspase-1水平不变而NLRP3的蛋白表达水平降低。4.3 KDM4B干扰和敲除均不影响LPS诱导的NF-κB活化用KDM4B+/+和KDM4B-/-腹腔原代巨噬细胞,以及KDM4B-siRNA和Ctrl-siRNA转染48h后的小鼠腹腔原代巨噬细胞,设计两组实验分别用LPS(200 ng/ml)刺激不同的时间(0,30min 60min),Western blot检测发现KDM4B干扰或敲除均不影响细胞裂解液中LPS诱导的p-IκBα表达。5.体内实验发现ML324抑制小鼠炎症5.1ML-324抑制LPS诱导的小鼠脓毒血症模型中IL-1β的分泌6-8周的C57BL/6小鼠(出生天数一致、体重均一)分别腹腔注射DMSO和ML324(40mg/kg),作用3h后,分对照组和实验组分别腹腔注射PBS(1ml/只)和LPS(10mg/kg)。2h内,摘除眼球静脉取血,用ELISA方法检测外周血血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌情况发现:ML324处理的小鼠模型中,血清中IL-1β的分泌较野生型减少,而TNF-α和IL-6的分泌不变。说明:ML324可以抑制LPS诱导的脓毒血症模型中NLRP3炎症小体的活化引起的IL-1β的分泌。5.2ML324缓解Alum诱导的小鼠腹膜炎模型6-8周的C57BL/6小鼠(出生天数一致、体重均一)分别腹腔注射DMSO和ML324(40mg/kg),作用3h后,分对照组和实验组分别腹腔注射PBS(1ml/只)和Alum(700μg),16h后收集小鼠腹腔灌洗液。小鼠腹腔灌洗液预处理后上流式细胞仪计数,统计分析每只小鼠腹腔渗出细胞的总数,中性粒细胞的数,以及Ly6C+单核细胞的数发现:ML324处理的小鼠实验组腹腔渗出细胞总数、中性粒细胞数量、以及Ly6C+单核细胞数量均比野生型减少;说明ML324抑制Alum诱导的小鼠腹膜炎中炎症细胞的浸润。结论1.组蛋白去甲基化酶KDM4B通过结合NLRP3基因启动子区,选择性促进NLRP3转录和NLRP3炎症小体活化。2.KDM4抑制剂ML324抑制NLRP3表达和NLRP3炎症小体活化,并缓解小鼠NLRP3炎症小体相关疾病模型进展。创新性及意义1.本研究揭示了 H3K9me3去甲基化酶KDM4B在NLRP3转录和NLRP3炎症小体活化中的作用,提示H3K9me3去甲基化可通过调控NLRP3表达参与炎症反应的调节。2.本研究揭示了 KDM4B和KDM4家族抑制剂ML324在NLRP3炎症小体活化中的作用,为NLRP3炎症小体活化失调导致的相关疾病治疗提供了新的靶标。