研究目的:宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)是指胎儿未能达到其遗传基因影响下的应有大小,是一种病理生理过程。IUGR会增加成年期发生肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病等代谢综合征的风险。其机制目前尚不十分清楚,目前被普遍认同的是“节约表型假说”,其核心内容为胎儿及新生儿早期营养不良会导致胰岛β细胞的发育异常及胰岛功能损伤,这种解剖结构和功能的变化可能导致成年后T2DM的发生。大量的研究发现,大鼠的胰岛β细胞需经过生后2-3周重塑过程才能有完整的功能,在这段时间给大鼠外源性药物刺激可以改变其胰岛β细胞的增殖水平。骨保护素(osteoprotegerin,OPG)最初是由于其在骨代谢中的重要作用而被广泛研究,近几年的研究发现OPG与胰岛β细胞增殖水平有着密切的关系。大量研究表明,PI3K/AKT通路在胰岛β细胞增殖中发挥着重要的作用,此外也有研究证实OPG在很多组织中可以激活PI3K/AKT通路。FoxO1在胰岛β细胞中表达,磷酸化修饰在FoxO1的核浆转移过程中起着重要的调节作用。PI3K/AKT信号通路激活后可促进FoxO1蛋白质磷酸化,促使FoxO1核输出并且阻断了核定位信号防止FoxO1重返核中,进而引起FoxO1转录活性改变。FoxO1转录活性的改变对细胞的增殖、分化、凋亡和及抗氧化应激等均有重要的影响,且其在改变胰岛β细胞增殖及功能中的作用也被学者研究证实。综上所述,本研究拟比较IUGR大鼠胰腺内OPG表达水平与正常大鼠间是否存在差异;进而明确在生后胰岛β细胞重塑期给予IUGR大鼠外源性OPG,是否影响其胰岛β细胞增殖;并探讨OPG影响胰岛β细胞增殖的过程中是否需要PI3K/AKT/FoxO1这一信号通路的参与,明确OPG影响胰岛β细胞增殖的机制。研究方法:采用孕期全程低蛋白饮食法建立IUGR大鼠动物模型,选择胰腺发育的关键时期,即生后1天、1周、3周及12周为时间点,取材后测量各组大鼠体重及胰腺重量。应用快速生化血糖仪测量空腹血糖,ELISA法测定空腹胰岛素,HE染色法观察胰岛形态,Ki67及胰岛素免疫荧光双染法观察胰岛β细胞增殖情况,通过Westen Blot、免疫组化、Real-time PCR方法检测胰腺组织中OPG蛋白和mRNA的表达。再选取正常及IUGR大鼠,随机分为三组,其中一组是IUGR+OPG组,即IUGR大鼠生后24小时内第一次腹腔注射重组人OPG,剂量为3ug/kg,隔日1次,直至用于取材或生后3周;另一组是IUGR组,即IUGR大鼠生后24小时内第一次腹腔注射与重组人OPG溶剂体积相同的注射用水,隔日1次,直至用于取材或生后3周;第三组为CON组,及正常大鼠生后24小时内第一次腹腔注射与重组人OPG溶剂体积相同的注射用水,隔日1次,直至用于取材或生后3周;选择生后1周、3周及12周为时间点。测量量各组大鼠体重、胰腺重量、空腹血糖及空腹胰岛素水平,并观察胰岛β细胞增殖情况。为探讨机制,首先选取生后12周大鼠胰腺做为研究对象,采用Westen Blot法测各组大鼠AKT、p-AKT、FoxO1、p-FoxO1、细胞浆内FoxO1及细胞核内FoxO1的表达水平。同时本实验还以INS-1细胞为研究对象,在细胞水平上进一步探讨机制。细胞分为四组,分别是CON组,即正常培养的INS-1细胞;OPG组,即在正常培养的INS-1细胞加入重组人OPG;LY组,即在正常培养的INS-1细胞加入LY294002;LY+OPG组,即在正常培养的INS-1细胞加入LY29400及重组人OPG。细胞药物干预48小时后应用CCK-8法测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞周期和凋亡,细胞周期蛋白Cyclin D1和Cyclin E的表达量、细胞凋亡相关蛋白bax和bcl2的表达量以及AKT、p-AKT、FoxO1、p-FoxO1、细胞浆内FoxO1及细胞核内FoxO1的表达水平均选取Westen Blot法进行检测。所得实验结果采用SPSS21.0软件对数据进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两变量之间的相关性分析采用Penrson相关分析法进行分析。结果:1、IUGR组大鼠出生体重明显低于CON组,这种情况一直持续生后3周,哺乳期后IUGR组出现生长追赶,至生后12周时,IUGR组体重与CON组体重无明显区别。IUGR组大鼠胰腺重量及胰腺重量/体重比值在所检测的各时间点均低于CON组。IUGR大鼠在生后12周出现高胰岛素血症及胰岛素抵抗。2、HE染色结果显示,子鼠胰岛β细胞团体积在所检测的各时间点IUGR组均低于CON组。Ki67和胰岛素免疫荧光双染结果表明,在所检测的各时间点IUGR组胰岛β细胞增殖水平均低于CON组。3、Westen Blot及免疫组化结果显示,OPG在大鼠胰岛上表达,且在所检测的各时间点,IUGR组OPG蛋白表达量均明显低于CON组。Real-time PCR的结果则提示,在所检测的各时间点,IUGR组OPGmRNA表达量明显低于CON组。4、相关性分析结果显示,胰腺组织中OPG蛋白及mRNA表达水平与胰腺重量呈正相关。5、注射重组人OPG的IUGR大鼠体重与未注射OPG的IUGR大鼠相比无明显差异,但胰腺重量及胰腺重量/体重的比值大于未注射OPG的IUGR大鼠。在生后12W时,IUGR+OPG组大鼠胰岛素水平及胰岛素抵抗指数均低于IUGR组。6、在生后1周、3周及12周,IUGR组大鼠的胰岛β增殖情况均明显低于对照组,而IUGR+OPG组大鼠胰岛β细胞增殖情况较IUGR组有所改善。7、生后12周,相较于正常对照组,IUGR大鼠胰腺组织中p-AKT及p-FoxO1蛋白表达显著降低,FoxO1蛋白在胞浆中表达显著减少,而在胞核中表达增高;给予重组人OPG治疗后,IUGR大鼠胰腺组织中AKT及FoxO1的磷酸化水平显著增高,FoxO1蛋白在胞浆中表达上升,在胞核中表达下降。结果表明,给予重组人OPG后可以使IUGR大鼠胰腺中AKT及FoxO1蛋白的磷酸化水平增高,细胞核内FoxO1减少,即具有活性的FoxO1减少,进而促进胰岛β细胞增殖。8、在细胞试验中,通过CCK-8检测细胞增殖发现,重组人OPG可促进INS-1细胞的增殖,而PI3K通路抑制剂LY294002可抑制细胞的增殖,同时予重组人OPG及LY294002刺激细胞则会抑制OPG诱导的细胞增殖。进一步通过流式细胞计数检测细胞周期,结果提示,与正常对照组相比,OPG组G0/G1期比例减少,S期和G2/M期比例增加,LY组与之恰恰相反,LY+OPG组的增殖指数低于OPG组。在凋亡检测结果中发现,OPG组细胞凋亡减少,LY组凋亡明显增加,而LY+OPG组的凋亡比例明显高于OPG组。最后在细胞水平探讨OPG促进胰岛β细胞增殖的机制,本研究发现OPG组p-AKT及p-FoxO1蛋白表达水平较CON组有所上升,FoxO1蛋白在胞浆中表达增高,在胞核中表达下降;LY组与之正好相反,p-AKT及p-FoxO1蛋白表达显著下降,FoxO1蛋白在胞浆中表达显著下降,在胞核中表达显著增高;而在LY+OPG组,LY294002抑制了被OPG促进的AKT及FoxO1的磷酸化水平,使其磷酸化水平较OPG组下降,且抑制了FoxO1在胞浆中的表达,促进了其在胞核中的表达。由此推断OPG可以通过激活PI3K/AKT/FoxO1通路,使FoxO1从细胞核内转移至细胞浆,进而促进细胞增殖。结论:1、本研究通过孕期全程低蛋白饮食法成功建立IUGR大鼠模型,IUGR组大鼠的生长发育较对照组落后,体重减低,胰腺重量减轻,胰岛β细胞增殖水平下降,并在生后12周出现胰岛素抵抗。2、OPG在CON组及IUGR组大鼠胰岛上均有表达,且在生长发育的各个关键时期IUGR组大鼠胰岛中OPG蛋白及mRNA表达水平均低于CON组大鼠。3、在生后胰岛β细胞重塑期,予IUGR大鼠注射重组人OPG可以促进其胰腺发育及胰岛β细胞增殖,改善胰岛素抵抗。4、OPG可以促进INS-1细胞增殖,促使细胞周期顺利从G0/G1期向S期和G2/M期过渡,并可抑制细胞凋亡。5、OPG促进细胞增殖的过程需要PI3K/AKT/FoxO1信号通路的参与。