脂环酸芽孢杆菌是一类具有嗜酸耐热特性的革兰氏阳性菌的统称,它能够造成多种果汁品质下降,严重影响果汁产业的健康发展。建立灵敏、精确的检测方法,方便高效的识别果汁中脂环酸芽孢杆菌的污染,一直是学者研究的热点,也是果汁企业亟待解决的关键。本研究以建立脂环酸芽孢杆菌的免疫检测体系为主线,通过解析脂环酸芽孢杆菌的细胞壁蛋白,寻找菌体表面潜在的特异识别靶点,并以此为抗原,制备了脂环酸芽孢杆菌的单克隆抗体,并最终实现了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的灵敏、特异识别。主要研究内容和结论如下:（1）选择脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3923作为研究对象,提取菌体细胞壁蛋白,并借助免疫蛋白质组学的研究手段对其中具有免疫原性的蛋白进行鉴定,结果表明:在A.acidoterrestris DSM 3923细胞壁上存在超过200个蛋白,集中分布在10-75 k Da之间,其中分子量范围在35-75 k Da之间的蛋白丰度较低,免疫原性也相对较弱;分子量范围在10-35 k Da之间的蛋白丰度较高,免疫原性也相对较强。在挑选的22个免疫原性蛋白中,成功鉴定出18个,归属于12类蛋白,其中有2种为新发现的免疫原性蛋白。这些蛋白可以参与碳水化合物和能量代谢、物质跨膜运输、催化氧化还原反应、应答氧化应激、维持细胞生长以及多肽合成,另有一种蛋白功能未知。（2）以12类免疫原性蛋白为研究对象,根据其编码基因序列进行引物设计,借助原核表达技术获得融合蛋白,并对其免疫原性进行再次验证,结果表明:通过合理设计获得的引物,可以用于特异扩增目的基因片段,产物长度与理论值一致,且无任何碱基突变。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下,目的基因可以在大肠杆菌中高效表达,其中4类融合蛋白以可溶性形式存在,其余融合蛋白形成包涵体。对利用镍柱纯化后的蛋白进行免疫原性分析发现,除苹果酸脱氢酶以外,其它11类蛋白均能与A.acidoterrestris多克隆抗体发生强烈的免疫反应。（3）选取假定蛋白N007＿08970作为免疫原,对BALB/c小鼠进行免疫,从而制备单克隆抗体,并对纯化的抗体进行效价和特异性评价,结果表明:经过4次腹腔注射免疫之后,6只小鼠均可产生较高效价的抗血清。选择5号小鼠用于细胞融合,最终筛选获得7株阳性杂交瘤细胞。将1G10细胞株注射入小鼠腹腔,通过腹水生产单克隆抗体,亚型鉴定为Ig G1-kappa。经过蛋白G亲和层析纯化后的抗体纯度较高,浓度为2.28 mg/m L,效价可达1:80000。Western blot分析结果发现制备的单克隆抗体可以与抗原发生强烈的免疫反应,且能专一地识别A.acidoterrestris DSM 3923细胞壁上相应的抗原靶点,具有极高的特异性。（4）以A.acidoterrestris单克隆抗体为捕获抗体,以A.acidoterrestris多克隆抗体为检测抗体,建立了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的间接夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）方法,结果表明:方法中单克隆抗体与多克隆抗体最佳工作浓度分别为2.5μg/m L和2μg/m L,酶标二抗的最佳稀释度为1:4000;抗体包被最适条件为4℃过夜;5%（v/v）脱脂奶粉封闭效果最好,封闭温度为37℃,封闭时间2h;菌体抗原与两种抗体以及多克隆抗体与酶标二抗的最适反应时间均为60 min;底物显色15 min之后,方法对脂环酸芽孢杆菌的检测效果最佳,在苹果汁中的检测限达5.4×102 CFU/m L。方法能够有效地区分目标菌与非目标菌,结果重复性与稳定性良好,可以在22h内对目标菌污染量为1 CFU/m L的果汁进行有效识别。（5）以脂环酸芽孢杆菌单克隆和多克隆抗体为核心,以对苯二胺为过氧化物酶底物,同时借助荧光素钠产生荧光信号,建立了具有比色和荧光双重信号模式的免疫检测体系,并对方法的检测性能进行评价,结果表明:当体系中单克隆抗体与多克隆抗体浓度均为2.5μg/m L,酶标二抗稀释度为1:5000时,方法对果汁中的脂环酸芽孢杆菌检测效果最好,两种模式下的检测限均可达4.8×102 CFU/m L,且具有优良特异性。本方法可以在24h内有效地识别脂环酸芽孢杆菌污染浓度为1 CFU/m L果汁样品。