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结直肠癌(Colorectalcarcinoma)是世界第三大癌症,每年导致超过500000人死亡。多种危险因素:包括生活方式、环境因素、基因突变等被认为是结直肠癌发生发展的主要原因。结直肠癌是自腺瘤到癌的一个连续过程,并伴随有发病率和死亡率变化。据研究报道,随着结直肠癌筛查的普及,一些早期无症状的病例得到了较以前相对及时的诊断和治疗,但是其最佳的筛查策略仍然没有被确定,因此,深入了解结直肠癌的发生发展机制,寻找新的结直肠癌生物标志物是极其重要的。最近,有研究表明MicroRNA(miRNA)在结直肠癌的诊断和预后中有较好的应用价值。miRNA,是一种小分子RNA,是重要的人类基因调控因子。存在有不少于1500种miRNA在人类miRNA信息库中,其在特别基因表达的转录校正系统中,通过3’末端非翻译区(UTR)发挥重要作用,并以此影响细胞程序发展和疾病状态。MicroRNA的异常表达可以引起人体内多种癌症的启动和发展。多种miRNA已经被证实与结直肠癌的的发生、发展和预后有很强的相关性。其中已有多项研究表明miR-125a-5p对结直肠癌的发生、发展有抑制作用。Smurf1是一种广泛存在于人体组织和器官的泛素连接酶,其可以对TGF-β和BMP信号通路进行调控,继而影响包括结直肠癌在内的多种肿瘤的发生发展。miR-125a-5p及Smurf1均在结直肠癌的发生发展中发挥重要作用,故而我们试图探究miR-125a-5p与Smurf1是否存在调控关系,以及这一调控关系对结直肠癌发生、发展的影响。本研究中,我们在体外和动物实验中观察miR-125a-5p在Smurf1表达中的调控作用。首先我们证实在CT26细胞中,Smurf1是miR-125a-5p的下游靶基因,并且其表达受miR-125a-5p的调节。在细胞水平中,高表达的miR-125a-5p可以抑制CT26和SW620细胞的增殖和迁移。而为了确认miR-125a-5p对细胞增殖和迁移的影响是否是建立在下调Smurf1的基础之上的,我们增加了miR-125a-5p Smurf1组,并通过与miR-125a-5p组对比以确定miR-125a-5p是否是通过Smurf1对细胞的增殖和迁移进行调控。体外的实验结果,可能会因为体内环境更为复杂而导致miR-125a-5p在体内的作用出现不同的结果。故而第三部分为了模拟肿瘤患者的体内环境,以转染了miR-125a-5p的CT26细胞建立鼠移植瘤模型,观察肿瘤生长状况,并检测其中Smurf1的蛋白表达以评价miR-125a-5p/Smurf1在体内的抗肿瘤作用。这些结果显示miR-125a-5p通过Smurf1的靶点可以成为结直肠癌的抑制性因素,这一研究可能会促进结直肠癌的诊断和治疗技术的发展。第一部分MiR-125a-5p通过Smurf1的3UTR调节Smurf1表达的研究目的:确定miR-125a-5p与Smurf1的作用位点,并检测转染miR-125a-5p后的Smurf1的转录和翻译水平,以验证miR-125a-5p对结直肠癌Smurf1表达的影响。方法:TargetScan来筛查Smurf1的位点,构建含有Smurf1基因的野生型3UTR或突变型3UTR的含有荧光基因的质粒载体并转入细胞,细胞再通过分别转染miR-125a-5pNC、miR-125a-5p来进行荧光素酶实验,以验证miR-125a-5p作用的位点是Smurf1的3UTR。再通过RT-qPCR实验和蛋白质印迹技术,来比较转染了miR-125a-5p和miR-125a-5pNC的Smurf1mRNA和Smurf1蛋白的表达情况。结果:1.TargetScan预测miR-125a-5p与Smurf1结合的位点是Smurf1的3UTR。2.miR-125a-5p对突变型Smurf1基因转染组的荧光活性并无明显影响。3.miR-125a-5p对野生型Smurf1基因转染组的荧光活性有明显抑制。4.miR-125a-5p的作用位点位于Smurf1的3UTR。5.Smurf1蛋白表达:转染了miR-125a-5p的实验组较对照组的Smurf1的表达明显减少。6.Smurf1的mRNA表达:转染了miR-125a-5p的实验组较对照组的Smurf1mRNA显著减少。结论:miR-125a-5p可以通过Smurf1的3UTR来抑制Smurf1的表达。第二部分MiR-125a-5p通过调节Smurf1抑制CT26细胞和SW620细胞增殖和迁移的研究目的:考虑到miR-125a-5p可以抑制Smurf1的表达,分析在细胞水平miR-125a-5p是否可以通过Smurf1对结直肠癌细胞的增殖和迁移进行调控。方法:在CT26细胞和SW620细胞中,建立分别转染miR-125a-5p、miR-125a-5p Smurf1、miR-125a-5pNC的细胞组,通过CCK-8细胞计数实验和细胞划痕实验检测上述各组间的差异。结果:1.CCK-8计数实验表明:转染miR-125a-5p可以使CT26细胞的增殖较对照组显著减少;转染miR-125a-5p Smurf1可以使CT26细胞的增殖较转染miR-125a-5p组显著增加。2.CCK-8计数实验表明:转染miR-125a-5p可以使SW620细胞的增殖较对照组显著减少;转染miR-125a-5p Smurf1可以使SW620细胞的增殖较转染miR-125a-5p组显著增加。3.细胞划痕实验表明:miR-125a-5p可以使CT26细胞的迁移较对照组显著减少;miR-125a-5p Smurf1可以使CT26细胞的迁移较转染miR-125a-5p组显著增加。4.细胞划痕实验表明:miR-125a-5p可以使SW620细胞的迁移较对照组显著减少;miR-125a-5p Smurf1可以使SW620细胞的迁移较转染miR-125a-5p组显著增加。结论:1.高表达的miR-125a-5p可以显著降低CT26细胞和SW620细胞的增殖和迁移能力。2.Smurf1可以显著提高CT26细胞和SW620细胞的增殖和迁移能力。3.miR-125a-5p可以通过下调Smurf1而抑制CT26细胞和SW620细胞的增殖和迁移。第三部分MiR-125a-5p在鼠移植瘤模型中抑制肿瘤生长的研究目的:分析体内环境下,miR-125a-5p对肿瘤组织的影响。方法:分别使用miR-125a-5p和阴性对照基因转染CT26细胞,并利用裸鼠建立鼠移植瘤模型,使用RT-qPCR技术检验实验组和对照组miR-125a-5p的表达。观察移植瘤的体积和重量并与对照组比较;进行免疫组化以测定Ki-67蛋白的相对表达,并与对照组进行比较;利用HE染色进行细胞计数,与对照组进行比较;利用蛋白质印迹技术分析实验组和对照组的Smurf1蛋白的表达,并进行比较。结果:1.实验组瘤体组织中miR-125a-5p的表达较对照组显著增高。2.实验组相较于对照组,可见肿瘤组织体积和重量减少。3.在免疫组化实验中,实验组中的Ki-67蛋白较对照组均显著降低。4.HE染色细胞计数结果表示:实验组较对照组细胞显著减少。5.Smurf蛋白的相对表达:实验组Smurf1的表达较对照组显著降低。结论:在动物实验中,miR-125a-5p可以通过下调Smurf1而对结直肠癌的生长有抑制作用。