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朊病毒病(PrionDiseases)或称传染性海绵状脑病(Transmissiblespongiformencephalopathies,TSEs)是一类传染性、致死性的神经退行性疾病,该病能够感染人和多种哺乳动物,主要包括疯牛病(BSE),羊痒病(Scrapie),鹿慢性消耗性疾病(CWD)和人的克雅氏病(CJD)等。目前的研究发现,朊蛋白基因(PRNP)的序列变异在一定程度上影响该种动物对TSE的易感性。我国目前虽然仍没有TSE疾病的发生,但随着国际间交流的日益频繁,我国急需针对TSE类疾病进行必要的技术储备和基础研究,因此本试验主要从以下几个方面进行了研究:
1.运用分子生物学技术,对中国梅花鹿的PRNP基因进行了克隆和序列分析,鹿PRNP基因ORF区包含771bp,编码256个氨基酸的前体蛋白。序列对比分析结果显示,中国梅花鹿PRNP基因与其它品种鹿PRNP基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均为98%以上。序列多态性分析发现了两个单核苷酸多态性(C408T,G676C),其中一处的核苷酸的变化导致了226位氨基酸处由谷氨酸到谷氨酰胺的改变,本试验为进一步研究中国梅花鹿朊蛋白序列多态性与其对CWD的易感性关系奠定基础。
2.对中国实验小型猪(CEMP)和北京大白猪的朊蛋白基因进行了克隆和序列分析,分析结果显示:猪PRNP基因ORF区全长为774bp,编码257个氨基酸的前体蛋白,序列高度保守,京白猪的PRNP序列与已发表的猪PRNP序列(L07623)完全一致,CEMP的PRNP序列与已发表的猪PRNP序列(L07623)有微小差异,仅在第四位氨基酸残基处导致了一个氨基酸的改变(Ser→Asn)。本试验为进一步研究中国两种猪对TSE的易感性奠定基础。
3.利用荧光定量PCR方法对猪脑及外周组织和器官中PRNP的表达进行了绝对定量分析。结果显示,不同组织、器官中猪PRNP基因表达存在差异,其中淋巴结中表达量最高,以后依次为:大脑,小脑,脑干,脾脏,胸腺和肌肉。颌下淋巴结比腹股沟淋巴结中PRNP表达量稍高,但组间差异不显著;脑干和肌肉与其它所检组织中PRNP表达量有显著性差异(P<0.05),本试验为研究猪PRNP的表达模式及正常朊蛋白的生理功能提供基础数据。
4.组织病理学诊断是TSE诊断的常规方法,而蛋白印记检测方法是国际公认的确诊TSE的方法。本研究利用组织病理学和蛋白印记检测方法,对北京周边鹿场的20只中国梅花鹿进行了CWD的检测,结果未发现阳性病例。本试验为我国防控外来病的发生提供了重要且必要的技术储备。