论文部分内容阅读
哺乳动物的心肌细胞尽管在胚胎期分裂增殖极为活跃,但在出生后不久即停止分裂增殖,退出细胞周期。在一些病理因素刺激下,心肌细胞可重新进入细胞周期,蛋白质和核酸合成增多,但一般不发生分裂,表现为细胞肥大。心肌肥大(cardiac hypertrophy)是高血压、心瓣膜病等多种心血管疾病的共同并发症,是心肌细胞对心脏长期过负荷工作的一种代偿性反应。研究表明,心肌肥大是心衰发生的独立危险因素,抑制心肌肥大能明显降低心衰的发生和死亡率。防治与逆转心肌肥大已成为高血压、慢性心衰等心血管疾病治疗的主要目标。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1a(cyclin-dependent kinase inhibitor 1a,CDKN1a)作为细胞周期的一种重要负性调节因子,在细胞周期进程中起着关键性的作用。就心肌细胞而言,CDKN1a在成年心脏中呈高表达,通过抑制细胞周期蛋白(cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)复合物的活性,使大多数细胞停滞在G0/G1期,在心肌肥大过程中发挥重要的作用。雷公藤甲素又称雷公藤内酯醇(triptolide,TP),具有调节CDKN1a表达的作用,但其对心肌肥大作用尚不明确。本课题旨在研究CDKN1a在心肌肥大中的调节机制,通过观察雷公藤甲素对CDKN1a的调节作用,探讨调节细胞周期防治心肌肥大的可行性。方法:1.传代培养H9c2细胞,MTT法检测H9c2对TP的耐受浓度。2.血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)1μmol/L孵育24h诱导H9c2细胞肥大反应。分别给予0.3、1、3、10μg/L的TP。荧光标记鬼笔环肽染色,荧光显微镜观察细胞形态,测定细胞面积。分别采用Real-time PCR和Western blot法检测H9c2细胞α-MHC、β-MHC、ANP、CDKN1a m RNA及蛋白表达变化情况。3.动物分组及模型建立:雄性小鼠30只,随机分为对照组、模型组、TP(10、30、100μg·kg-1·d-1)以及TP对照组(n=5),分别给予生理盐水、恒速异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)灌注(40 mg·kg-1·d-1,14d)、ISO灌注+TP(10、30、100μg·kg-1·d-1,ip,qd)、TP(30μg·kg-1·d-1,ip,qd)。另取小鼠20只,随机分为对照组、模型组、CDKN1a抑制剂组、cdkn1a腺病毒组,对照组与模型组处理同前;cdkn1a抑制剂组给予iso灌注+3mg/kg的柄曲霉素(ip,qd);cdkn1a腺病毒组股静脉注射2×107tu的ad-cdkn1a腺病毒。4.实验过程中,密切观察小鼠一般状况及死亡情况。末次给药后,称量体重,称重法测定小鼠心脏指数。分别采用he和masson染色观察心肌组织病理变化与胶原沉积情况。麦胚凝集素染色心肌细胞膜观察计算细胞平均面积。5.分别采用real-timepcr和westernblot法检测心肌组织中α-mhc、β-mhc、anp、cdkn1amrna及蛋白表达变化。结果:1.0.1~10μg/l的tp孵育24h,h9c2细胞的生长没有明显变化,30μg/l浓度的tp则明显抑制细胞生长(p<0.05)。而1.0~30.0μg/ltp作用48h明显抑制细胞的生长(p<0.01)。2.模型组h9c2细胞面积明显大于对照组,而在1、3、10μg/l三个剂量tp作用下,细胞面积显著减小。模型组α-mhcmrna和蛋白质较对照组明显降低,β-mhc、anp、cdkn1a的mrna和蛋白质表达则明显增高。1、3、10μg/l的tp能显著升高α-mhcmrna及其蛋白质表达,减少β-mhc、anp、cdkn1a的mrna及其蛋白质表达。3.对照组小鼠皮毛顺滑有光泽,精神状态佳,进食活动自如;模型组小鼠则呼吸急促,活动较少;tp给药处理组、tp对照组、cdkn1a腺病毒组小鼠活动与进食情况明显优于模型组。4.iso灌注模型组小鼠心肌损伤明显,心脏指数显著升高,tp(30、100μg/kg)及柄曲霉素能明显改善心肌组织损伤,降低心脏指数。5.模型组动物心肌纤维断裂明显,纤维间隙与血管周围胶原沉积,而tp(10、30、100μg/kg)和柄曲霉素组纤维化程度明显减轻。6.模型组心肌细胞平均面积明显升高,而tp(10、30、100μg/kg)和柄曲霉素组心肌细胞面积明显降低。7.iso灌注明显下调小鼠心肌组织中α-mhcmrna和蛋白质表达,上调β-mhc、anp、cdkn1amrna和蛋白质表达。与模型组相比,tp(30、100μg/kg)能明显纠正上述α-mhc、β-mhc、anp、cdkn1amrna和蛋白质表达的异常;而10μg/kgtp组α-mhcmrna和anp蛋白表达与模型组相比,差异不显著(p>0.05)。cdkn1a抑制剂柄曲霉素处理组α-MHC mRNA及其蛋白表达较模型组明显升高,而β-MHC、ANP、CDKN1a的m RNA和蛋白表达则显著降低。结论:1.体外培养心肌细胞H9c2肥大反应及小鼠心肌肥大过程中伴随着细胞周期抑制因子CDKN1a的表达升高。2.雷公藤甲素能显著抑制血管紧张素II诱导的体外培养H9c2细胞肥大反应。3.雷公藤甲素能有效减轻异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大和心肌纤维化。4.雷公藤甲素的抗心肌肥大作用可能与其抑制细胞周期抑制因子CDKN1a表达,纠正α-MHC、β-MHC平衡失调有关。