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铜绿假单胞菌是一种机会性致病病原体,临床上最常见的三大条件致病菌之一,是免疫受损个体和肺囊性纤维化患者主要致病因子。铜绿假单胞菌侵入肺上皮后从非褐藻胶产生菌株(非粘液型)到褐藻胶产生菌株(粘液型)的遗传转化有利于细菌生物膜的形成并粘附在肺粘膜并发生细菌的免疫逃逸,导致临床上持续性,难治性感染。褐藻胶是一种酸性多糖,是铜绿假单胞菌生物膜的细胞外多糖的关键成分。褐藻胶裂解酶能通过β-消除反应直接靶向破坏生物膜中的褐藻胶成分从而发挥作用,因此不涉及耐药性问题,该策略已成为有效的治疗铜绿假单胞菌感染的新策略并且引起了极大的关注。尽管已经表征了各种褐藻胶裂解酶,但目前所发现的褐藻胶裂解酶受到活性低、稳定性差的限制,难以用于临床治疗。因此寻找高活力、高稳定性的褐藻胶裂解酶并且通过一定的方法提升其生物性质成为研究的热点。在该研究中,从海洋细菌Vibrio sp.SY01中克隆了PL7家族的褐藻胶裂解酶编码基因aly08并在大肠杆菌中表达。利用Ni-NTA柱亲和纯化法从发酵上清液中得到纯酶,SDS-PAGE分析表明达到电泳纯,分子量为35 kDa,命名为Aly08。Aly08在最佳pH(pH 8.35)和温度(45°C)下显示出大约841.1 U/mg的比活性。同时,Aly08显示出良好的pH稳定性和耐热性。高液相色谱(HPLC)分析及质谱分析(ESI-MS)结果表明Aly08以内切方式高效的将褐藻胶降解为二糖和三糖。利用96孔板模型和flow cell模型检测,Aly08对铜绿假单胞菌生物膜具有抑制和清除作用。为了进一步改善褐藻胶裂解酶生物学特性和抗生物膜活性,以离子交联法将纯酶Aly08固定在壳聚糖(CS-NPs)上构建纳米粒。与游离酶相比,固定化酶的生物学性质显著增强,如热稳定性和可重复使用性。通过共聚焦显微镜确定铜绿假单胞菌生物膜的生物量和厚度,固定化酶和游离酶Aly08直接处理的铜绿假单胞菌PAO1生物膜其厚度分别是21.7±5.1μm和49.6±7.3μm,对于已形成的生物膜,固定化酶也表现出更好的效果,因此固定化酶在抑制生物膜形成和去除成熟铜绿假单胞菌生物膜方面比游离酶表现出更高的效率。此外,当用固定化酶Aly08和抗生素共同处理铜绿假单胞菌PAO1时,Aly08介导的生物膜分散增加了抗生素直接靶向细菌从而杀死细菌的能力从而显著增加了铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性。综上所述,褐藻胶裂解酶Aly08具有较高活性及较好的温度稳定性和碱适应性以及高效降解褐藻胶底物的能力,同时固定化的褐藻胶裂解酶-壳聚糖纳米粒将有助于褐藻胶裂解酶作为抗生物膜剂的进一步开发。