乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是严重危害人类健康的重要病原体,可导致急慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。尽管HBV预防性疫苗已获得有效推广,但目前世界上仍有超过3.5亿的乙肝感染者,仍缺乏有效的治疗药物。目前对于慢性乙肝感染导致的肝硬化及肝癌等的终末期肝病的致病机制仍不十分清楚,其重要制约因素之一是缺乏合适的慢乙肝动物模型。研究显示,水动力高压注射小鼠模型可用于在小鼠肝脏高效表达外源基因,并已应用于建立HBV短期表达小鼠模型,该模型被认为可用于部分模拟人体内HBV的慢性感染状态,具有良好的应用潜力。因此,本研究拟应用水动力高压注射方法探索建立一种更为高效的HBV耐受表达小鼠模型。本研究首先探索了采用不同的小鼠品系对HBV感染性克隆载体在体内持续表达能力的影响。基于对小鼠遗传背景的分析,本研究选择了 BALB/c、C57BL/6、C3;B6-Tg(AAVS1)AlXob/J(AAVS1)等小鼠作为评价对象,应用水动力高压注射方法将HBV感染性克隆载体pAAV-1.2HBV对小鼠进行尾静脉注射。结果显示,在4种小鼠中AAVS1小鼠具有较好的表达效果,其血清HBsAg水平可达到103-4IU/mL。AAVS1小鼠为人AAVS1位点转基因小鼠,其受体胚胎由C57BL/6和C3H/HeJ受精卵发育而来,可在外源Rep蛋白介导下实现AAV载体在细胞内的整合。为此,本研究进一步探索了 AAVS1小鼠体内的转基因元件是否与pAAV-1.2HBV注射后可产生良好的表达效果有关。通过同时对AAVS1转基因阳性小鼠(AAVS1 TG)与AAVS1转基因阴性小鼠(AAVS1-/-)进行pAAV-1.2HBV的尾静脉高压注射,比较表达效果显示AAVS1-/-小鼠的HBsAg表达水平与AAVS1TG小鼠相比并无显著差异,均可维持稳定表达超过2个月。因此可以认为,AAVS1转基因元件位点对AAVS1小鼠的HBV耐受表达并无影响。本研究进一步探讨了 HBV感染性克隆的连接载体背景是否会对HBV在小鼠体内持续表达产生影响。通过选取均携带有HBV 1.2倍基因组感染性克隆的pAAV-1.2HBV与pcDNA3.1-1.2HBV进行比较。结果显示,pAAV载体的表达效果优于pcDNA3.1载体,pcDNA3.1载体组的HBsAg水平在注射后约1个月即转阴,而pAAV载体组在注射后1个月依然维持高效表达,其表达水平高于pcDNA3.1载体组约2个数量级。HBcAg是HBV在天然感染的免疫过程中具有高度免疫原性的特异性抗原,本研究探索了 HBcAg的表达与HBV感染性克隆在小鼠体内持续表达能力的关系。分别将可表达HBcAg感染性克隆载体(pAAV-1.2HBV)与不能表达HBcAg的感染性克隆载体(pAAV-1.2HBV-core-null)对小鼠进行尾静脉高压注射。结果显示,HBcAg表达缺陷的pAAV-1.2HBV-core-null组的HBsAg水平相比对照pAAV-1.2HBV组高近2个数量级。这说明HBcAg的表达在机体清除HBV中起到较为重要的作用,并影响了 HBV感染性克隆载体在小鼠体内的表达水平。本研究进一步探讨了小鼠性别对AAVS1小鼠模型HBV耐受表达效果的影响。结果显示,雄性小鼠的模型构建成功率、表达持续性和表达效率均显著高于雌性小鼠,其构建成功率为80%,表达持续时间可超过6个月,血清中HBsAg水平可达 103IU/mL。本研究进一步将建立的HBV耐受表达小鼠模型应用于靶向HBV的siRNA体内抗病毒效果评估。结果显示,本研究构建的HBV耐受表达小鼠模型可用于HBV抗病毒药物的评估,经siRNA治疗后,小鼠体内HBsAg的表达可获得显著抑制,治疗后第4天即接近阴性水平。综上所述,本研究成功建立了 HBV小鼠耐受表达模型,为进一步开展慢乙肝相关的治疗性药物的评估与筛选,以及HBV慢性感染机制研究提供重要的基础。