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范可尼贫血(Fanconi anemia,FA)是一种常染色体隐性遗传性疾病,以染色体不稳定,细胞对DNA交联剂如丝裂霉素C、顺铂高度敏感为特征,并且高度易患癌症,主要包括急性髓系白血病(AML),头颈部鳞状细胞癌,妇科癌症等。目前已将FA基因分为13种FA互补群(A,B,C,D1,D2,E,F,G,I,J,L,M和N),其中12种FA基因已被克隆出来,它们通过共同途径组成一个多蛋白核心复合物,在FA通路中发挥重要作用,这也是FANCD2蛋白单泛素化所必须的。FANCF蛋白是范可尼贫血蛋白互补基团的重要成员之一,FANCF作为一种重要的衔接蛋白,参与FA复合体的稳定及FANCD2泛素化激活过程,因此是维持FA通路功能所必需的重要蛋白。FANCF通过FA通路,参与细胞周期的调控、细胞凋亡、DNA的修复、基因转录与基因稳定性等多种生命信号的转导与调控。FANCF蛋白低表达及功能缺失与FANCF基因启动子超甲基化相关。目前,已在多种肿瘤(卵巢癌,口腔癌,肺癌和宫颈癌)中证实FANCF蛋白低表达或功能缺失与肿瘤的发生、发展相关。关于FANCF、FANCD2在AML和骨髓增生异常综合征(MDS)中的研究国内尚未有报道。本实验拟通过检测FANCF基因的甲基化状态和FANCF、FANCD2蛋白的表达,探讨AML、MDS的发病机制及与预后的关系,为治疗提供新的策略。材料和方法一、研究对象2007年9月份至2008年7月份中国医科大学附属第一医院血液科就诊的AML患者111例,其中男62例,女49例,男女比例1.2:1,中位年龄56岁。初诊64例,完全缓解(CR)27例,复发20例。MDS患者46例,其中低危组(RA8例、RAS10例)18例,高危组(RAEB13例,RAEB-T15例)28例,中位年龄67岁,男女比例1:1。对照组42例,为巨幼细胞贫血、缺铁性贫血或血小板减少性紫癜患者。诊断符合FAB诊断标准。二、方法(1)密度梯度法提取骨髓单个核细胞。(2)酚-氯仿-酚反复离心法抽提DNA。(3)MS-PCR检测FANCF基因的甲基化状态。(4)免疫组织化学染色法检测FANCF、FANCD2蛋白。(5)Western印迹法检测FANCF、FANCD2蛋白。(6)统计学方法:用SPSS13.0统计软件处理分析,计量资料采用非参数检验中的Kruskal-Wallis秩和检验,计数资料用X~2检验,描述性分析采用中位数(M)。实验结果一、AML FANCF基因甲基化状态初诊的AML患者甲基化程度高于对照组和CR组AML患者,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);复发组与初诊组比较无统计学意义(P>0.05),与CR组和对照组比较有统计学意义(P<0.05);CR组AML患者与对照组比较,甲基化状态差别无统计学意义(P>0.05)。二、AML FANCF、FANCD2蛋白的表达免疫组织化学染色检测显示FANCF蛋白在AML初诊组表达率9.3%,CR组表达率74.1%,复发组表达率10.0%,对照组表达率80.9%;Western印迹法检测显示初诊组表达率31.2%,CR组表达率77.8%,复发组表达率30.0%,对照组表达率95.2%。初诊组与对照组、CR组表达率比较,两组数据有统计学意义(P<0.01);复发组与初诊组比较无统计学意义(P>0.05),与CR组和对照组比较有统计学意义(P<0.05);CR组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。免疫组织化学染色检测显示FANCD2蛋白在AML初诊组表达率6.3%,CR组表达率63.0%,复发组表达率5.0%,对照组表达率71.4%;Western印迹法检测显示初诊组表达率34.3%,CR组表达74.1%,复发组表达率35.0%,对照组表达率88.1%。初诊组与对照组、CR组表达率比较,两组数据有统计学意义(P<0.01);复发组与初诊组比较无统计学意义(P>0.05),与CR组和对照组比较有统计学意义(P<0.05);CR组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。三、MDS FANCF基因甲基化状态MDS患者高危组和低危组均表现出高甲基化状态,与对照组的差异有统计学意义(P<0.01);MDS患者高危组甲基化程度高于低危组,两组比较有统计学意义(P<0.05)。四、MDS FANCF、FANCD2蛋白的表达免疫组织化学检测显示FANCF蛋白在MDS低危组表达率5.6%、高危组表达率3.6%,对照组表达率80.9%;Western印迹法检测显示低危组表达率11.1%,高危组表达率7.1%,对照组表达率95.2%,MDS病例组与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学检测显示FANCD2在MDS低危组表达率16.7%、高危组表达率7.1%,对照组表达率71.4%;Western印迹法检测显示低危组表达率22.2%,高危组表达率10.7%,对照组表达率88.1%,MDS病例组与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。结论本研究显示AML患者组FANCF基因甲基化状态显著高于对照组,且初治AML甲基化状态高于CR组,提示FANCF基因高甲基化可能在AML的发病过程中起到一定的作用。FANCF蛋白在对照组中高表达,初诊和复发AML组中FANCF蛋白表达明显减低或缺失,提示FANCF蛋白与AML的发病和预后具有一定相关性。MDS患者组FANCF基因甲基化状态显著高于对照组,且高危MDS组FANCF甲基化状态高于低危组,提示FANCF基因的高甲基化可能在MDS的病情发展过程中起到一定作用。FANCF蛋白在低危、高危MDS患者中表达率较对照组明显减低,提示FANCF蛋白与MDS的发病可能具有相关性。FANCD2蛋白的表达情况与FANCF蛋白一致。