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研究背景:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是导致终末期肾病的1型和2型糖尿病的主要微血管性并发症。持续微量白蛋白尿被广泛用作早期DN的生物标志物,这表明肾功能逐渐下降。足细胞是终末分化的细胞,不能增殖,并连同内皮细胞和肾小球基底膜形成肾小球滤过屏障。微小RNA(mi RNA)是单链的小的非编码RNA(21~25个核苷酸),通过与蛋白质编码基因的m RNA结合来抑制其翻译来调节基因表达。累积研究表明mi RNA参与各种疾病的发病机制,包括肾脏疾病。BCL2基因家族及其相关蛋白bcl-2是最早研究的凋亡相关基因。本研究旨在通过体内体外实验探索mi R-134-5p是否能够通过调节bcl-2蛋白表达而参与DN的病理过程。材料与方法:1.8周龄的雄性小鼠共20只,其中C57BL/KsJ db/db小鼠10只作为模型组,C57BL/Ks J db/m小鼠10只作为正常对照组,持续高血糖20周后,小鼠颈椎脱臼处死,立即分离所有肾组织。将采集的肾脏样品进行HE和PAS染色观察肾小球,系膜基质和毛细血管基底膜的变化。同时免疫组化和免疫荧光检测肾组织中bcl-2蛋白和小鼠肾脏足细胞标记蛋白nephrin的表达水平的变化。2.利用微阵列mi RNA分析显示差异表达的mi RNA。3.利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测在高糖诱导下不同时间点永生型人足细胞中mi R-134-5p表达水平的变化。4.经高糖(H,30m M右旋葡萄糖)处理的条件永生化人足细胞中抗mi R-134-5p以及经正常糖(NG,5m M右旋葡萄糖)处理的足细胞中过表达mi R-134-5p转染后,利用q RT-PCR分析mi R-134-5p、nephrin相对应的m RNA的表达;利用蛋白质印迹分析nephrin蛋白、凋亡相关蛋白cleaved caspase3的表达水平;利用流式细胞术分析对足细胞凋亡的影响。5.利用双荧光素酶报告分析验证mi R-134-5p是否直接靶向bcl-2 3’非翻译区(3’-UTR);在HG处理的足细胞中用抗mi R-ctrl或抗mi R-134-5p转染以及在NG处理的足细胞中用mi R-ctrl或mi R-134-5p转染后,通过蛋白质印迹分析bcl-2的表达水平变化。6.经HG处理的足细胞中抗mi R-ctrl或抗-mi R-134-5p和sh-Bcl2表达质粒共转染以及经NG处理的足细胞中mi R-ctrl或mi R-134-5p和bcl-2表达质粒共转染后,通过蛋白质印迹测量nephrin和bcl-2蛋白的表达水平。利用蛋白质印迹和流式细胞术分析检测对细胞凋亡的影响。研究结果:1.HG诱导足细胞中mi R-134-5p的上调表达。2.Mi R-134-5p促进足细胞的凋亡。3.萤光素酶测定验证mi R-134-5p的直接靶标为bcl-2。4.抑制bcl-2增强mi R-134-5p的促细胞凋亡效应,而过度表达bcl-2减弱了凋亡效应。结论:1.高糖诱导足细胞中mi R-134-5p的上调表达并促进凋亡效应。2.Mi R-134-5p通过靶向bcl-2功能性促进足细胞凋亡。