中国西北地区苹果黑星病菌遗传多样性、抗药性监测及秦冠抗黑星病机制研究

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苹果黑星病(Venturia inaequalis)是世界性的苹果真菌病害,可危害寄主叶片、枝条和果实,严重时导致早期落叶,特别是在欧洲、美洲苹果产区每年造成严重的经济损失。该病害典型症状是在果实上形成黑色的疮痂病斑,又俗称苹果疮痂病(Apple Scab)。苹果黑星病自上世纪20年代在我国河北省发现以来,随着苹果产业的发展而向其他省份扩展蔓延。上世纪80年代,西北黄土高原地区大力发展苹果产业,使我国苹果产业发展重心逐渐由东部向西部地区转移。该病害于上世纪90年代中后期,曾经在陕西、甘肃和新疆一度发生流行,此后病害的发生危害逐渐减轻和消退,但在个别地方仍有零星发生和危害。然而随着西北地区苹果产业的快速发展,近年来苹果黑星病在有些地方的发生危害又死灰复燃,特别是在陕西渭北部分苹果产区、甘肃秦岭和六盘山有的山地苹果产区,以及新疆伊犁河谷苹果产区的发生危害十分严重,并呈现出逐年加重的趋势,该病害已成为影响当地农民脱贫致富的重要制约因素之一。因此,为了进一步摸清近年来西北地区苹果黑星病菌的遗传亲缘关系及传播路径,揭示其对果园常年使用的杀菌剂苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯的抗药性发展水平,探究秦冠对苹果黑星病的抗性机制等科学和生产实际问题,本文对此开展了相关研究,并取得以下结果:1.采用单孢分离方法,对从陕西、甘肃、新疆三地采集的457个苹果黑星病菌标样中,共分离纯化出164个菌株,占比为35.89%。其中,陕西53个,占分离纯化总数的32.32%;甘肃37个,占分离纯化总数的22.56%;新疆74个,占分离纯化总数的45.12%。2.采用ITS序列分析对上述苹果黑星病菌单孢菌株及收集的11个英国苹果黑星病菌株进行“种”的分子鉴定。采用真核生物核糖体DNA通用引物ITS1和ITS4对苹果黑星病菌r DNA-ITS区进行扩增、PCR产物电泳检测和测序,测序结果登陆NCBI,进行Nucleotide BLAST对比。结果表明,参试的166个苹果黑星病菌株,其同源相似度均在97%以上,故鉴定为苹果黑星病菌(Venturia inaequalis(Cooke)Wint.)。3.应用SSR分子标记技术,对132个国内采集分离的和英国收集的苹果黑星病菌株进行了遗传多样性分析,构建了遗传聚类图,分析了不同地域间菌株群体的遗传距离、分子方差和群体遗传结构。结果表明:在相似度为0.74时,所有供试菌株全部聚类在一起;在相似度为0.76的水平时,供试菌株群体可划分为2个类群:其中第一类群下可再细分为亚群,有部分新疆菌株和少量英国和甘肃菌株被分在了第Ⅰ亚群,但不包含陕西的菌株。所有陕西菌株全划分到第II亚群,还有一些英国菌株也归于此亚群。其中,第II亚群下又可分为几个小的亚群,大部分英国菌株均在第(1)小亚群,其中也包括全部来自陕西苹果品种嘎啦、Fuji、九月奇迹的菌株和新疆华丹、华红的菌株。第(2)小亚群则包含全部来自陕西粉红女士,新疆蜜脆,以及多数新疆野苹果的菌株;第(3)小亚群则仅有一个陕西菌株、部分甘肃和新疆的菌株。第二群则只有一个英国的菌株以及少量新疆、甘肃的菌株。分析结果表明,在陕西,菌株的遗传亲缘关系与地理来源有一定的相关性,而新疆和甘肃的菌株则无明显的相关性。分子方差分析结果表明,132个苹果黑星病菌株的遗传变异有91%来源于种群内部,9%来源于种群间,说明种群间有着较为频繁的基因交流。4.采用菌丝生长速率法,从陕西、甘肃和新疆采集分离的90个苹果黑星病菌株,对果园常年使用的杀菌剂苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯的敏感性或抗药性进行了研究。结果表明,参试菌株对苯醚甲环唑的EC50值范围在0.1431-6.7354μg/m L,最大与最小值的比率为47.07,平均EC50值为1.467±1.562μg/m L。通过Shapiro-Wilk检验,显示其EC50值不符合正态分布(W=0.9595,P<0.05),表明参试菌株存在着对苯醚甲环唑敏感性较低的群体,并建立了抑制率平均值为0.8790±0.7589μg/m L的相对敏感基线。通过对各地参试菌株的EC50值进行比较分析表明,陕西菌株对苯醚甲环唑的敏感性最高,新疆的次之,甘肃的最低。参试菌株对吡唑醚菌酯的EC50值范围为0.1369-2.0256μg/m L,最大值和最小值的比率为15.95,平均EC50值为0.4538±0.4362μg/m L。通过Shapiro-Wilk检验其EC50值显示不符合正态分布(W=0.6656,P<0.05),表明群体中也存在着对吡唑醚菌酯敏感性较低的群体,并建立了抑制率平均值为0.2386±0.06506μg/m L相对敏感基线。通过对各地参试菌株的EC50值进行比较分析表明,陕西菌株对吡唑醚菌酯的敏感性最高,新疆的次之,甘肃的最低。另外,研究表明,杀菌剂苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯之间不存在交互抗性现象。5.应用电镜技术,在接种苹果黑星病菌强致病力菌株Ca183后,对苹果黑星病抗病品种秦冠和感病品种嘎啦的叶片进行了超微结构观察研究。结果表明:抗病品种秦冠叶片的角质层厚度高于感病品种嘎啦,其中,秦冠角质层厚度的平均值为1.75μm,嘎啦的为1.06μm。通过电镜观察,在接种14d后嘎啦比秦冠叶片栅栏组织受到更为严重的伤害,主要表现为细胞萎缩,排列松散,细胞呈椭圆形,叶绿体变形,细胞器数量减少,细胞质流失严重,几乎成空胞;接种后21d,嘎啦出现大量细胞坏死,而秦冠只有少量细胞坏死。由此表明,秦冠苹果在组织和细胞学上对苹果黑星病具有抗侵染、抗扩展和延缓病程发展的作用。
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