目的 圆锥角膜是一种局限性的角膜圆锥样突起并伴有突起区角膜基质变薄的疾病，发病率约达1/2000，它对青少年的视力危害较大。曾有学者发现圆锥角膜的发生与先天发育异常或是遗传有关且或伴随Down综合征或Leber’s先天性黑朦症，但随着研究的深入，人们发现在其发生过程中还存在着胶原异常及细胞凋亡现象，并存在有与器官的早老过程相似的现象。为证实细胞衰老在圆锥角膜发病中可能发挥的作用，本研究对圆锥角膜基质细胞内端粒长度的变化以及圆锥角膜基质内衰老标记蛋白-30(senescence marker protein-30，SMP-30)和衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-beta-galactosidase)的表达进行了检测，以探讨这些分子标志物在圆锥角膜发生发展中的临床意义。 方法 一、实验材料 病变组收集2006年1月至12月间于山东省眼科研究所青岛眼科医院接受角膜移植治疗的圆锥角膜患者(32人)的病变角膜37份，其中男性(25人)标本29份，女性(7人)标本8份，患者年龄13～34岁，平均19.4±4.7岁，标本获取后均立即置于-80℃超低温冰箱贮存。正常对照组标本为青岛眼科医院眼库中供临床上穿透性角膜移植术后剩余的供体角膜组织，共20份，供体年龄9～25岁，平均19.2±4.4岁，标本也置于-80℃超低温冰箱保存。 二、Southern Blot杂交检测端粒长度(一)、总DNA的提取光学显微镜下机械法刮除角膜标本的上皮及内皮，应用DNA提取试剂盒分别提取21份病变角膜及12份正常角膜标本基质细胞的总DNA，检测总DNA浓度确定适用。 (二)、Southern Blot杂交技术检测病变角膜基质细胞和正常角膜基质细胞的端粒长度1、酶切基因组DNA等比配制内切酶Hinf Ⅰ-Rsa Ⅰ混合物，使每种内切酶的浓度为20U/μl。配制20μl的样本DNA反应体系：取样本DNA至微离心管内使每份样品DNA含量达到1μl，加入无核酸酶水使每个样本均稀释到17μl后，每样本加入2μl10×digestionbuffcr及1μl内切酶混合物(含内切酶Hinf Ⅰ-Rsa Ⅰ各20U/μl)，混匀，37℃孵育3h。 2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段加入4μl 5×loading buffer于酶切后的样本中，将样本及DIG molecular weightmarker分别加入0.8％琼脂糖凝胶电泳泳道，12V/cm恒压电泳约1.5h。 3、转膜印记 制备转膜三明治(滤纸-尼龙膜-琼脂糖凝胶-滤纸)，于半干转膜仪中0.5mA/cm<2>恒流转膜10min。 4、杂交及化学发光的检测将尼龙膜浸入15ml 42℃预热后的预杂交液中，42℃预杂交1h后，弃去预杂交液。加入5ml含端粒探针(浓度)的杂交液，42℃杂交3h。分别用不同浓度的洗液洗尼龙膜，以地高辛碱性磷酸酶抗体孵育后结合化学发光底物。暗室内X-ray胶片曝光检测化学发光。 三、老化标记物的检测(一)检测衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-beta-galactosidase)的表达分别将病变角膜和正常角膜基质常规制作石蜡切片，将切片进行脱蜡水化处理。处理后的切片加入细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒中的β-半乳糖苷酶染色固定液，室温反应15min，0.02M PBS室温洗涤3次，每次5min，同时按照试剂盒说明书配制染色工作液(10μl β-半乳糖苷酶染色液A，10μl β-半乳糖苷酶染色液B，930μl β-半乳糖苷酶染色液C，50μl X-gal溶液)，染色工作液浸泡切片37℃~育24～30h。 (二)RT-PCR法检测SMP-30的表达分别提取圆锥角膜及正常角膜基质细胞的总mRNA，通过RT-PCR对角膜基质细胞内SMP-30的mRNA表达水平进行检测。PCR所用引物根据人的SMP-30mRNA序列，使用primer 3软件进行设计，序列如下：上游5ccg tgg atg cct ttg actat 3，下游5caa ctt cat gC tgct ttg ga 3；PCR产物片段大小为233bp。四、组织学观察常规制作病变和正常角膜的石蜡切片，采用苏木素-伊红(HE)染色并于光学显微镜下观察病变角膜和正常角膜基质的组织学及基质细胞密度的变化。 结果 1、圆锥角膜基质细胞的端粒长度为10.29～14.12kb，平均端粒长度为11.54±1.41 kb；正常角膜基质细胞的端粒长度为12.64～15.32 kb，平均端粒长度为13.45±0.99 kb；统计学分析显示两者差异明显，具有统计学意义(P<0.05)，说明圆锥角膜基质细胞的端粒长度短于正常角膜基质细胞。 2、组织学观察显示正常角膜基质纤维排列规则紧密，而圆锥角膜基质胶原纤维排列呈现疏松不规则；正常角膜基质内的角膜细胞规则地分布在基质中，但圆锥角膜基质细胞分布较前者散乱且数量减少。 3、组织化学染色揭示圆锥角膜基质内X-gal染色可见散在分布蓝色阳性着色，表明存在衰老相关-β-半乳糖苷酶的表达；而正常角膜基质中X-gal染色阴性，未见衰老相关-β-半乳糖苷酶表达。RT-PCR检测结果发现圆锥角膜及正常角膜中均无SMP-30蛋白的表达。 结论 与正常角膜基质相比，圆锥角膜基质细胞的端粒长度有所缩短，基质中β-半乳糖苷酶表达增加，提示圆锥角膜可能是一种与组织异常老化有关的疾病，这为揭示圆锥角膜的发病机制提供了新的理论和证据。