在大面积深度烧伤病人的救治中，尽早的进行皮肤移植修复创面是治疗成功的关键所在。但大面积烧伤患者自体皮源的缺乏往往限制了早期大面积植皮的可能。异体皮和异种皮移植成为了有效地替代方案[1]。其中，异体皮移植相比异种皮移植，其组织结构与人体相同，且有着较低的免疫原性。异体皮作为临时的创面覆盖物，不仅可为自、异体皮肤混合移植术提供良好的局部创面愈合条件，而且还可形成新的暂时体表屏障，避免或减轻创面感染，减少创面渗出，从而减轻烧伤后的全身病理生理改变。然而，异体皮移植同样面临着供体和皮源不足的问题，使其价格高昂，作为临时的皮肤替代物难以为大部分患者所接受。同时，必然存在的排异反应也使其移植效果难以预计。为了解决皮源缺乏的问题，人们将目光转向了组织工程皮肤的研究，通过在人造真皮支架材料上种植人皮肤种子细胞形成组织工程皮肤，以之作为异体皮的替代物覆盖创面。其中，皮肤种子细胞作为组织工程皮肤的主要生物学成分，是其发挥生物学作用的核心[2]。在之前的研究中，我们采用CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体转染人永生化角质形成细胞（HaCaT），获得了稳定转染，长期表达RNA干扰效果，CCL20稳定敲低的转染株HaCaT细胞[3]。CCL20基因特异性敲低的转染株细胞，有着较低的免疫源性，同时也保留了HaCaT细胞的永生化和易培养的特性。作为低免疫排斥反应的皮肤组织工程种子细胞具有独特的优势。在后续实验中，我们发现，获得稳定转染的多株转染株细胞其细胞生长特性无论是在生长曲线还是细胞周期上相对未转染的HaCaT细胞都发生了较大的改变[4]。众所周知，CCL20作为免疫细胞的诱导趋化因子，其生物学功能明确，在体外培养和非炎症条件下极少发挥生物学作用。从既往文献报道和相关体外研究实验中，都未发现CCL20基因的改变会造成细胞生长特性发生变化的例子[5]。因此，我们有相信，这种改变并非来自CCL20基因的敲低，而是慢病毒载体对细胞的转染造成的，是慢病毒载体DNA对宿主细胞基因组的大量插入的结果[6]。在基因工程和基因疗法中，病毒载体转染造成的不可预计的宿主基因组改变一直是造成操作失败乃至产生严重副作用的原因。而最为严重的副作用莫过于宿主细胞产生成瘤性。众所周知，皮肤源性的肿瘤的发生本来就与以人乳头瘤病毒（HPV）为代表的多种病毒的感染相关[7]。因此慢病毒转染的HaCaT细胞同样存在产生成瘤性的可能，而细胞生长特性的改变正是值得警惕的信号之一。考虑到蛋白质作为发挥细胞生物学功能的基础物质，直接决定细胞的表型。为了初步了解慢病毒载体对转染株细胞在蛋白层面造成了什么样的影响，我们采用二维电泳技术对转染株细胞进行了差异蛋白组学分析。电泳结果显示转染株细胞相较HaCaT细胞存在一定程度上蛋白表达的改变。我们选取了部分差异蛋白进行了质谱鉴定，并对差异蛋白中的核纤层蛋白B1进行了RT-PCR和WB验证。并初步分析了上游因子caspase6(细胞凋亡蛋白酶6)的活性和核纤层蛋白B1的关系。为了进一步更加全面和深入的分析慢病毒载体对各转染株细胞的影响，我们采用人表达谱芯片（Agilent SurePrint G3Human GE8*60K Microarray, Agilent Technologies，USA）和iTRAQ技术对转染株细胞和HaCaT细胞的表达谱和蛋白谱进行了检测，绘制了更加详尽的表达谱和蛋白谱。通过一系列的生物信息学分析，了解慢病毒载体转染对皮肤种子细胞基因表达和蛋白表达产生的影响，分析慢病毒转染人角质形成细胞基因转录和蛋白表达的变化规律，并结合慢病毒载体的基因内整合位点信息进一步探索造成种子细胞表型改变的可能原因和的成瘤性隐患，材料与方法：第一部分慢病毒载体稳定转染人角质形成细胞差异蛋白组学检测及高表达核纤层蛋白B1的分析我们选择生长曲线发生明显改变的第Ⅰ株转染株细胞作为实验组，以未转染HaCaT细胞作为对照组。提取细胞总蛋白后实验组与对照组一一配对后进行二维电泳，各进行三次生物学重复。采集电泳图像，进行差异蛋白分析。选择其中表达改变最为明显的部分蛋白点切胶后进行质谱鉴定。选择差异蛋白中的核纤层蛋白B1，通过RT-PCR和WB技术对其mRNA含量和蛋白含量进行定量验证。再通过采用不同浓度顺铂诱导caspase6激活后，观察不同caspase6活性情况下，核纤层蛋白B1的表达情况，了解caspase6活性与核纤层蛋白B1含量的关系。第二部分慢病毒载体稳定转染人角质形成细胞克隆的表达谱和蛋白谱分析我们选择生长曲线发生明显改变的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅲ株转染株细胞作为实验组，以未转染HaCaT细胞作为对照组。提取细胞总RNA，对提取的总RNA纯化后进行质检。确认RNA质量符合检测要求后，对总RNA中的mRNA进行放大和标记，并对标记后的cRNA进一步进行纯化。将纯化后的cRNA与表达谱芯片在杂交炉中进行杂交，洗片后扫描芯片，对原始信号进行归一化处理后得到两组细胞mRNA的相对含量数据。各组细胞成对进行三次生物学重复，共得到3对6组芯片数据。通过生物信息学方法，对两株细胞的差异表达谱进行分析，寻找造成细胞生长特性改变的可能原因。同时，我们提取上述四株转染株细胞的总蛋白，定量后以同样的上样量进行SDS电泳纯化及胶内酶解。纯化后的蛋白通过iTRAQ试剂进行标记，标记后的肽段混合后进行SCX分离，然后进入液质联用质谱进行鉴定。对鉴定出的蛋白和相对定量值通过生物信息学方法进行差异蛋白谱分析。并结合整合位点信息和差异表达谱信息进行关联分析。结果：第一部分二维电泳显示转染株细胞与HaCaT细胞存在一定程度的蛋白表达差异，选择差异蛋白点进行质谱鉴定，鉴定出差异蛋白7个。选择其中的核纤层蛋白B1通过WB和RT-CPR进行验证，两者结果都显示其在转染株细胞中的表达在mRNA层面(P<0.01)和蛋白层（P=0.038）面都明显升高。同时通过顺铂诱导细胞凋亡，观察到在不同caspase6活性下，核纤层蛋白B1mRNA含量及蛋白含量随caspase6活性的升高而明显下降（P<0.01）第二部分1.转录组的改变基因芯片检测结果显示转染株细胞存在明显的差异表达现象，其差异探针数占检出探针数的比率皆高于15%。其中转染株Ⅱ和转染株Ⅲ的差异基因数和差异lincRNA数都明显高于其余两株(6411/1243;5474/1255)。同时，我们还发现，在四组转染株细胞的差异基因中，其表达下调的mRNA比例显著高于表达上调的mRNA。但与此相对的是，除转染株Ⅰ以外，表达上调的lincRNA却显著多余表达下调的lincRNA。在差异表达谱的GO富集分析方面，我们发现除转染株Ⅰ外，三株细胞都共同富集于辅因子结合功能（cofactor binding）、转移酶活性（transferase activity）和氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）等功能条目。在生物学进程富集上，氧化应激（oxidationreduction）和细胞增殖（cell proliferation）以及各种调节进程在多个转染株中都存在富集，同时各个转染株也有着自身特异的富集进程。而通路(pathway)富集显示出丝裂原活化蛋白激酶通路（MAPKinase Signaling Pathway）的共同富集倾向。2.蛋白组的改变质谱鉴定在四株转染株细胞中共鉴定出3200个蛋白。与表达谱所展现出来的明显表达差异不同，蛋白谱的差异蛋白（foldchange>1.5;p<0.05）数量相对较少，差异蛋白占总蛋白数的比率在2.38-10.28%之间。但与差异表达谱相吻合的是，转染株Ⅱ的差异蛋白数量明显高于其余三株细胞。但同时，转染株Ⅲ、Ⅲ的上调蛋白多于下调蛋白，转染株Ⅰ、Ⅱ的上调蛋白却少于下调蛋白。在GO富集分析方面，各转染株细胞都有着富集于蛋白结合相关功能条目的倾向。同时转染株Ⅲ在功能和途径上都明显富集于氧化应激反应进程（oxidation-reduction process），转染株Ⅲ和转染株Ⅲ明显的表现出在细胞死亡和凋亡相关通路中的富集倾向，转染株Ⅱ的差异蛋白在诸多病毒感染相关生化进程中存在着高度富集。在通路富集方面，转染株Ⅰ、Ⅲ、Ⅲ的富集倾向并不显著，但转染株Ⅱ在核糖体通路（ribosome）存在着明显的差异基因富集。3.结合慢病毒载体基因内整合位点的分析对差异表达谱，蛋白谱和慢病毒载体基因内整合位点信息进行分析后我们发现。三者同时能够匹配的基因数目很少，且都不具有蛋白和mRNA层面的显著差异，说明三者的关联性较小。但差异基因和蛋白谱存在一定程度的关联，但这种关联与各株细胞的整体表达差异多寡没有可见的相关性。结论：1、慢病毒载体转染的HaCaT细胞在基因表达谱方面显示出了显著的改变。表明慢病毒载体转染对宿主细胞的mRNA表达产生了巨大的影响。同时我们还发现，差异表达的基因中，表达下调的基因明显多于表达上调的基因。2、所有四株慢病毒转染HaCaT细胞克隆在丝裂原活化蛋白激酶通路都存在着差异基因的富集。3、四株转染株细胞的蛋白谱改变明显小于对应转染株的基因表达谱改变。4、转染株Ⅱ在基因表达谱和蛋白谱方面的改变都是四株转染株中最为显著的。5、差异基因表达谱、蛋白谱和编码基因内插入位点能够关联整合的部分极少。在转染株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中分别有4，6和2个基因吻合。6、RT-CPR和WB证实了二维电泳的结果，核纤层蛋白B1在转染株Ⅰ中无论在mRNA还是蛋白层面都存在上调。同时随着caspase6活性的增加，细胞内核纤层蛋白B1的含量降低。