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蓝藻水华在世界范围内的频繁暴发引起了国内外的广泛关注，伴随其产生的微囊藻毒素(Microcystins，MCs)对水生生物的生长、发育构成了极大威胁。大量证据表明，MCs不但是典型的肝毒素，还具有明显的神经毒性，可对鱼类神经系统产生不利影响。为了系统评估MCs引发的鱼类神经毒性效应，本研究选取MCs中毒性最强、分布最为广泛的异构体微囊藻毒素-LR(MCLR)作为实验材料和模式生物斑马鱼(Danio rerio)作为实验动物，一方面，结合体外急性暴露和体内亚慢性暴露两种方式揭示MCLR诱发的斑马鱼胚胎发育神经毒性的分子机制，另一方面，选取一种纳米材料—纳米二氧化钛(nano-TiO2)作为MCLR的载体，进一步全面深入探究MCLR导致斑马鱼神经毒性的分子机理。发育中的神经系统比成熟的神经系统更容易受到化学物质影响，因此在神经毒性测试中，应特别注意发育神经毒性。本研究首先结合MCLR体外急性暴露和环境相关浓度MCLR体内亚慢性暴露两种染毒模式，从MCLR的蓄积、斑马鱼胚胎生长发育终点指标、斑马鱼仔鱼游泳行为、仔鱼神经递质含量、神经递质合成、分泌以及神经元发育相关基因的表达等方面探究MCLR对斑马鱼胚胎发育神经毒性效应及其分子机制；其次，选择nano-TiO2作为MCLR的载体，用MCLR和nano-TiO2联合暴露成年斑马鱼，从行为学、组织病理学、氧化应激水平(酶活性和基因表达)等方面来揭示MCLR诱导斑马鱼成鱼脑损伤的分子机制；最后，通过MCLR和nano-TiO2联合暴露亲代斑马鱼实验，检测子代行为、眼部组织学、细胞凋亡相关酶活性和基因表达等多个终点指标，全面评估单独或联合暴露对子代眼部发育的影响，并进一步探究MCLR诱发神经毒性的致毒机制。本研究为系统地评估MCLR的神经毒性效应、母代传递效应及联合暴露毒性效应提供了重要的实验依据。主要结果如下：
1.在体外急性暴露实验中，将斑马鱼胚胎暴露于0、0.8、1.6和3.2mg/LMCLR120h。实验结果显示，MCLR可在斑马鱼仔鱼体内大量蓄积，并导致斑马鱼胚胎孵化延迟和仔鱼体长降低，以及斑马鱼仔鱼的游泳速度显著降低。此外，暴露组斑马鱼仔鱼体内多巴胺和乙酰胆碱含量也显著降低，1.6和3.2mg/LMCLR暴露组斑马鱼仔鱼体内乙酰胆碱酯酶活性显著升高。MCLR暴露后，与多巴胺含量、乙酰胆碱含量和乙酰胆碱酯酶活性变化相关的基因manf、chrna7和ache的表达水平显著变化。同时，本实验还检测了与神经元发育相关的基因的表达情况，发现α-tubulin、shha、mbp和gap43异常表达。以上结果表明MCLR诱发的发育神经毒性可能是通过对胆碱系统、多巴胺信号和神经元发育的干扰引起的。
2.在体内亚慢性暴露实验中，F0代斑马鱼暴露于环境相关浓度(0、1、5和25μg/L)MCLR60天后，于清水中产卵并孵化至120h。检测结果显示，在F0代斑马鱼性腺和F1代胚胎内均可检测到MCLR的存在，表明MCLR可以从亲代传递给子代，且MCLR的母体传递可导致F1代仔鱼活动显著减慢。神经递质检测实验发现，多巴胺、二羟基苯乙酸和血清素的含量在F1仔鱼(5和25μg/LMCLR暴露组)体内显著下降。另外，暴露组F1代仔鱼体内乙酰胆碱酯酶活性显著降低，且与神经递质含量以及乙酰胆碱酯酶活性相关的基因(manf、bdnf、ache、htr1ab、htr1b、htr2a、htr1aa、htr5a、DAT、TH1和TH2等)的表达水平出现显著变化。与神经元发育相关的基因α-tubulin、syn2a、mbp、gfap、elavl3、shha和gap43中，除了gap43外，其他的基因水平均上调。综上所述，MCLR可以从亲代传递给子代并最终通过干扰神经递质系统和神经元的发育诱发F1代斑马鱼胚胎的发育神经毒性。
3.将成年斑马鱼单独暴露于(0、0.5、4和32μg/L)MCLR，或与nano-TiO2(100μg/L)联合暴露45天后发现，MCLR暴露可引发斑马鱼游泳行为和社交行为异常，且nano-TiO2的存在进一步加剧了这些行为的异常。此外，MCLR单独暴露或联合暴露均会引起脑组织损伤，且这种损伤不具有性别特异性。本实验检测了脑组织氧化应激相关酶活和基因表达水平，发现MCLR可通过引发斑马鱼脑组织的氧化应激来引起脑组织损伤，进而导致斑马鱼游泳行为和社交行为异常，且nano-TiO2是通过进一步加剧MCLR诱发的斑马鱼脑组织损伤来引起行为的异常。
4.成年斑马鱼分别单独暴露于环境相关浓度(0、0.5、4和32μg/L)MCLR或联合暴露于nano-TiO2(100μg/L)45天后在清水中收集子代胚胎并孵化培养至120h。结果表明，nano-TiO2可以显著增加MCLR在子代斑马鱼胚胎体内的蓄积。此外，MCLR与nano-TiO2联合暴露进一步抑制了子代斑马鱼胚胎的发育、减慢了仔鱼的游泳速度以及加剧了仔鱼眼部的发育异常。本实验进一步通过细胞凋亡检测、蛋白质表达和酶活性检测等手段探究了其潜在的分子机制。分析实验结果可发现，MCLR是通过线粒体介导的细胞凋亡途径来引发子代眼部发育异常，进而干扰子代仔鱼游泳行为，且nano-TiO2是通过加剧子代眼部发育异常和游泳行为异常来加剧MCLR的母代传递效应。本实验研究了MCLR和nano-TiO2的生物累积、母代传递效应和发育神经毒性，揭示了MCLR和nano-TiO2联合暴露的健康风险。
1.在体外急性暴露实验中，将斑马鱼胚胎暴露于0、0.8、1.6和3.2mg/LMCLR120h。实验结果显示，MCLR可在斑马鱼仔鱼体内大量蓄积，并导致斑马鱼胚胎孵化延迟和仔鱼体长降低，以及斑马鱼仔鱼的游泳速度显著降低。此外，暴露组斑马鱼仔鱼体内多巴胺和乙酰胆碱含量也显著降低，1.6和3.2mg/LMCLR暴露组斑马鱼仔鱼体内乙酰胆碱酯酶活性显著升高。MCLR暴露后，与多巴胺含量、乙酰胆碱含量和乙酰胆碱酯酶活性变化相关的基因manf、chrna7和ache的表达水平显著变化。同时，本实验还检测了与神经元发育相关的基因的表达情况，发现α-tubulin、shha、mbp和gap43异常表达。以上结果表明MCLR诱发的发育神经毒性可能是通过对胆碱系统、多巴胺信号和神经元发育的干扰引起的。
2.在体内亚慢性暴露实验中，F0代斑马鱼暴露于环境相关浓度(0、1、5和25μg/L)MCLR60天后，于清水中产卵并孵化至120h。检测结果显示，在F0代斑马鱼性腺和F1代胚胎内均可检测到MCLR的存在，表明MCLR可以从亲代传递给子代，且MCLR的母体传递可导致F1代仔鱼活动显著减慢。神经递质检测实验发现，多巴胺、二羟基苯乙酸和血清素的含量在F1仔鱼(5和25μg/LMCLR暴露组)体内显著下降。另外，暴露组F1代仔鱼体内乙酰胆碱酯酶活性显著降低，且与神经递质含量以及乙酰胆碱酯酶活性相关的基因(manf、bdnf、ache、htr1ab、htr1b、htr2a、htr1aa、htr5a、DAT、TH1和TH2等)的表达水平出现显著变化。与神经元发育相关的基因α-tubulin、syn2a、mbp、gfap、elavl3、shha和gap43中，除了gap43外，其他的基因水平均上调。综上所述，MCLR可以从亲代传递给子代并最终通过干扰神经递质系统和神经元的发育诱发F1代斑马鱼胚胎的发育神经毒性。
3.将成年斑马鱼单独暴露于(0、0.5、4和32μg/L)MCLR，或与nano-TiO2(100μg/L)联合暴露45天后发现，MCLR暴露可引发斑马鱼游泳行为和社交行为异常，且nano-TiO2的存在进一步加剧了这些行为的异常。此外，MCLR单独暴露或联合暴露均会引起脑组织损伤，且这种损伤不具有性别特异性。本实验检测了脑组织氧化应激相关酶活和基因表达水平，发现MCLR可通过引发斑马鱼脑组织的氧化应激来引起脑组织损伤，进而导致斑马鱼游泳行为和社交行为异常，且nano-TiO2是通过进一步加剧MCLR诱发的斑马鱼脑组织损伤来引起行为的异常。
4.成年斑马鱼分别单独暴露于环境相关浓度(0、0.5、4和32μg/L)MCLR或联合暴露于nano-TiO2(100μg/L)45天后在清水中收集子代胚胎并孵化培养至120h。结果表明，nano-TiO2可以显著增加MCLR在子代斑马鱼胚胎体内的蓄积。此外，MCLR与nano-TiO2联合暴露进一步抑制了子代斑马鱼胚胎的发育、减慢了仔鱼的游泳速度以及加剧了仔鱼眼部的发育异常。本实验进一步通过细胞凋亡检测、蛋白质表达和酶活性检测等手段探究了其潜在的分子机制。分析实验结果可发现，MCLR是通过线粒体介导的细胞凋亡途径来引发子代眼部发育异常，进而干扰子代仔鱼游泳行为，且nano-TiO2是通过加剧子代眼部发育异常和游泳行为异常来加剧MCLR的母代传递效应。本实验研究了MCLR和nano-TiO2的生物累积、母代传递效应和发育神经毒性，揭示了MCLR和nano-TiO2联合暴露的健康风险。