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卵巢癌目前是全球妇科疾病中最致命的癌症，也是女性癌症死亡的原因之一，5年生存率在15％到25％之间。目前的治疗方案主要包括肿瘤切除术和化疗。化疗药物首选铂类药物，然而卵巢癌患者极易对铂类药物产生耐药性。因此，研究卵巢癌耐药机制，对改善卵巢癌的治疗现状具有重要的意义。我们之前的研究表明MCT4在卵巢癌组织高表达，参与卵巢癌的能量代谢，能够将卵巢癌糖酵解产生的乳酸排出细胞，维持癌细胞的恶性表型。有研究表明肿瘤细胞内乳酸水平的增加或许与化学抵抗之间存在着一定的关系，而MCT4是否能够参与卵巢癌的耐药尚无研究报道。本课题旨在通过CRISPR/Cas9技术获得MCT4缺失的卵巢癌细胞SKOV3，进而探讨MCT4与SKOV3细胞顺铂敏感性之间的关系，并探索其分子机制。
本研究主要分为以下三个部分：
第一部分：利用CRISPR/Cas9技术敲除卵巢癌细胞SKOV3中的MCT4分子
目的：利用CRISPR/Cas9技术，构建MCT4敲除的SKOV3细胞。
方法：
1.通过CHOPCHOP网站，设计MCT4的sgRNA序列。
2.通过传统的分子克隆技术构建CRISPR/Cas9系统相关的载体。
3.通过双酶切产物凝胶电泳和DNA测序技术鉴定重组载体。
4.将构建好的载体转染至SKOV3细胞，经G418筛选，再通过单克隆化获得单克隆细胞株。通过WesternBlot，RT-PCR，细胞基因组PCR检测SKOV3细胞中MCT4的表达。
结果：
1.在CHOPCHOP网站搜索SLC16A3(MCT4)基因，可以得到324条sgRNA序列，根据其综合得分情况，选择第二外显子上两个得分较高的靶点作为sgRNA。
2.双酶切产物凝胶电泳结果和DNA测序结果显示成功构建pX330-Cas9-sgRNA1，pX330-Cas9-sgRNA2，pcDNA3.1-sgRNA-donor-polyA载体，pX330-Cas9为本实验室现有。
3.将pX330-Cas9-MCT4sgRNA1、pcDNA3.1-sgRNA-donor-polyA、pX330-Cas9和pX330-Cas9-MCT4sgRNA2、pcDNA3.1-sgRNA-donor-polyA、pX330-Cas9分别共转染至SKOV3细胞，以600μg/ml的G418浓度进行筛选，有限稀释法获得单克隆细胞，通过WesternBlot，RT-PCR，细胞基因组PCR进行鉴定。结果显示：SKOV3细胞的MCT4被成功敲除，将该细胞命名为SKOV3-MCT4-KO。
第二部分：制备MCT4抗体并评价三种免疫方案
目的：制备MCT4抗体并评价质粒免疫、细胞免疫、多肽免疫这三种免疫方案。
方法：
1.制备免疫原：构建pcDNA3.1-MCT4载体、MCT4过表达的Renca细胞、选择MCT4分子中序列最长、特异性最好的胞外段合成肽段。
2.通过质粒免疫、细胞免疫、多肽免疫三种免疫方案免疫小鼠，ELISA实验和WesternBlot实验检测小鼠血清中抗体滴度及其特异性。
3.通过杂交瘤技术制备MCT4单克隆抗体，WesternBlot和细胞免疫荧光实验检测抗体的特异性及其与细胞表面天然抗原的结合能力。
4.制备MCT4兔多克隆抗体，ELISA，WesternBlot，细胞免疫荧光实验检测抗体滴度、特异性及与细胞表面天然抗原的结合能力。
结果：
1.双酶切产物凝胶电泳显示pcDNA3.1-MCT4载体构建成功；WesternBlot结果显示，稳定过表达MCT4的Renca细胞构建成功。
2.以获得的免疫小鼠血清为抗体，WesternBlot，ELISA实验结果显示：多肽免疫效果最佳，细胞免疫次之，质粒免疫效果不显著。
3.以获得的杂交瘤单克隆细胞上清为抗体，WesternBlot结果为阳性，细胞免疫荧光实验结果为阴性，表明：获得的单克隆细胞株可以产生特异性的抗MCT4的抗体，但是不能识别卵巢癌细胞上天然的MCT4分子。
4.以获得的MCT4多克隆抗体为一抗，ELISA，WesternBlot，细胞免疫荧光实验结果显示：制备的多克隆抗体可以与MCT4特异性结合，也能识别卵巢癌细胞上天然的MCT4分子。
第三部分：MCT4在卵巢癌细胞中的功能及其机制研究
目的：探究MCT4在卵巢癌细胞顺铂耐药中的功能及其机制。
方法：
1.利用已经构建成功的SKOV3-MCT4-KO细胞和多克隆抗体，通过CCK8实验、彗星实验和乳酸检测试剂盒，检测MCT4敲除或抗体处理后细胞对顺铂的敏感性及乳酸排出水平的变化。
2.通过转录组测序，筛选SKOV3-MCT4-KO和SKOV3的差异表达基因。
3.通过RT-PCR实验检测卵巢癌组织和正常卵巢组织中MCT4与目标差异基因的mRNA表达情况及其相关性。
4.通过回复实验：在SKOV3-MCT4-KO细胞中分别过表达MCT4和目标差异基因，通过CCK8实验和彗星实验检测细胞对顺铂的敏感性。
结果：
1.SKOV3细胞的MCT4分子缺失或经抗体处理后，细胞对顺铂的敏感性显著上升，DNA损伤水平也显著上升，细胞乳酸外排能力明显减弱，细胞内乳酸堆积。
2.转录组测序结果显示：SKOV3和SKOV3-MCT4-KO细胞的所有差异基因中TREX1基因表达差异最显著，并且，这两种细胞的基因表达在顺铂耐药通路中也存在着显著性差异。
3.RT-PCR结果显示：在卵巢癌组织和正常卵巢组织中，MCT4与TREX1基因均高表达，且为正相关关系。
4.回复实验结果显示：在SKOV3-MCT4-KO细胞中分别过表达MCT4和TREX1，细胞会恢复对顺铂药物的敏感性。在2μg/ml的顺铂处理下，细胞DNA损伤程度明显减弱。
结论：MCT4的高表达与卵巢癌细胞的顺铂耐药特性密切相关，这种关系可能与细胞内TREX1的表达有关。且MCT4的缺失也会引起细胞内乳酸堆积，肿瘤的酸性环境与化疗耐药之间也存在着关联。因此，我们认为MCT4可能通过影响TREX1的表达进而参与卵巢癌的耐药，这一过程可能也与细胞内乳酸的变化密切相关。
本研究主要分为以下三个部分：
第一部分：利用CRISPR/Cas9技术敲除卵巢癌细胞SKOV3中的MCT4分子
目的：利用CRISPR/Cas9技术，构建MCT4敲除的SKOV3细胞。
方法：
1.通过CHOPCHOP网站，设计MCT4的sgRNA序列。
2.通过传统的分子克隆技术构建CRISPR/Cas9系统相关的载体。
3.通过双酶切产物凝胶电泳和DNA测序技术鉴定重组载体。
4.将构建好的载体转染至SKOV3细胞，经G418筛选，再通过单克隆化获得单克隆细胞株。通过WesternBlot，RT-PCR，细胞基因组PCR检测SKOV3细胞中MCT4的表达。
结果：
1.在CHOPCHOP网站搜索SLC16A3(MCT4)基因，可以得到324条sgRNA序列，根据其综合得分情况，选择第二外显子上两个得分较高的靶点作为sgRNA。
2.双酶切产物凝胶电泳结果和DNA测序结果显示成功构建pX330-Cas9-sgRNA1，pX330-Cas9-sgRNA2，pcDNA3.1-sgRNA-donor-polyA载体，pX330-Cas9为本实验室现有。
3.将pX330-Cas9-MCT4sgRNA1、pcDNA3.1-sgRNA-donor-polyA、pX330-Cas9和pX330-Cas9-MCT4sgRNA2、pcDNA3.1-sgRNA-donor-polyA、pX330-Cas9分别共转染至SKOV3细胞，以600μg/ml的G418浓度进行筛选，有限稀释法获得单克隆细胞，通过WesternBlot，RT-PCR，细胞基因组PCR进行鉴定。结果显示：SKOV3细胞的MCT4被成功敲除，将该细胞命名为SKOV3-MCT4-KO。
第二部分：制备MCT4抗体并评价三种免疫方案
目的：制备MCT4抗体并评价质粒免疫、细胞免疫、多肽免疫这三种免疫方案。
方法：
1.制备免疫原：构建pcDNA3.1-MCT4载体、MCT4过表达的Renca细胞、选择MCT4分子中序列最长、特异性最好的胞外段合成肽段。
2.通过质粒免疫、细胞免疫、多肽免疫三种免疫方案免疫小鼠，ELISA实验和WesternBlot实验检测小鼠血清中抗体滴度及其特异性。
3.通过杂交瘤技术制备MCT4单克隆抗体，WesternBlot和细胞免疫荧光实验检测抗体的特异性及其与细胞表面天然抗原的结合能力。
4.制备MCT4兔多克隆抗体，ELISA，WesternBlot，细胞免疫荧光实验检测抗体滴度、特异性及与细胞表面天然抗原的结合能力。
结果：
1.双酶切产物凝胶电泳显示pcDNA3.1-MCT4载体构建成功；WesternBlot结果显示，稳定过表达MCT4的Renca细胞构建成功。
2.以获得的免疫小鼠血清为抗体，WesternBlot，ELISA实验结果显示：多肽免疫效果最佳，细胞免疫次之，质粒免疫效果不显著。
3.以获得的杂交瘤单克隆细胞上清为抗体，WesternBlot结果为阳性，细胞免疫荧光实验结果为阴性，表明：获得的单克隆细胞株可以产生特异性的抗MCT4的抗体，但是不能识别卵巢癌细胞上天然的MCT4分子。
4.以获得的MCT4多克隆抗体为一抗，ELISA，WesternBlot，细胞免疫荧光实验结果显示：制备的多克隆抗体可以与MCT4特异性结合，也能识别卵巢癌细胞上天然的MCT4分子。
第三部分：MCT4在卵巢癌细胞中的功能及其机制研究
目的：探究MCT4在卵巢癌细胞顺铂耐药中的功能及其机制。
方法：
1.利用已经构建成功的SKOV3-MCT4-KO细胞和多克隆抗体，通过CCK8实验、彗星实验和乳酸检测试剂盒，检测MCT4敲除或抗体处理后细胞对顺铂的敏感性及乳酸排出水平的变化。
2.通过转录组测序，筛选SKOV3-MCT4-KO和SKOV3的差异表达基因。
3.通过RT-PCR实验检测卵巢癌组织和正常卵巢组织中MCT4与目标差异基因的mRNA表达情况及其相关性。
4.通过回复实验：在SKOV3-MCT4-KO细胞中分别过表达MCT4和目标差异基因，通过CCK8实验和彗星实验检测细胞对顺铂的敏感性。
结果：
1.SKOV3细胞的MCT4分子缺失或经抗体处理后，细胞对顺铂的敏感性显著上升，DNA损伤水平也显著上升，细胞乳酸外排能力明显减弱，细胞内乳酸堆积。
2.转录组测序结果显示：SKOV3和SKOV3-MCT4-KO细胞的所有差异基因中TREX1基因表达差异最显著，并且，这两种细胞的基因表达在顺铂耐药通路中也存在着显著性差异。
3.RT-PCR结果显示：在卵巢癌组织和正常卵巢组织中，MCT4与TREX1基因均高表达，且为正相关关系。
4.回复实验结果显示：在SKOV3-MCT4-KO细胞中分别过表达MCT4和TREX1，细胞会恢复对顺铂药物的敏感性。在2μg/ml的顺铂处理下，细胞DNA损伤程度明显减弱。
结论：MCT4的高表达与卵巢癌细胞的顺铂耐药特性密切相关，这种关系可能与细胞内TREX1的表达有关。且MCT4的缺失也会引起细胞内乳酸堆积，肿瘤的酸性环境与化疗耐药之间也存在着关联。因此，我们认为MCT4可能通过影响TREX1的表达进而参与卵巢癌的耐药，这一过程可能也与细胞内乳酸的变化密切相关。