神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是指“来自外周或中枢神经系统病变或功能紊乱所引起的疼痛”,临床涉及范围广泛，感染、创伤、代谢性疾病、神经受压缺血、放化疗等原因均可诱发,其特征表现为痛觉异常、痛觉过敏、甚至自发性疼痛。中枢敏化是目前解释NP的主要理论,脊髓、丘脑、皮质水平均可发生中枢敏化,但关注最多的还是作为伤害性传递的第一中继站脊髓水平。强烈的伤害性刺激可诱发活性依赖的中枢敏化,但在NP中,中枢敏化主要归因于胶质细胞的激活、周围免疫细胞的浸润和慢性神经炎症的形成。CD4+T细胞各亚群的平衡失调与众多疾病的发生发展有着密切的关系,包括NP。研究发现,损伤神经局部浸润的Thl、Th17细胞与NP的发展有关,Th2细胞作用相反；神经损伤后,脊髓内亦发现有CD4+T细胞的浸润,但其具体亚群及其功能目前并不清楚。CNS内浸润的Th17细胞,是伴有NP疼痛特征的多发性硬化症及实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)的主要病理损伤者,但其是否直接介导了NP的形成,目前并不清楚。本项目通过体内外两方面研究神经损伤后,浸润至脊髓内的CD4+T细胞的具体亚群,探索Th17细胞的中枢敏化作用及机制,为进一步了解中枢浸润的免疫细胞在NP中的作用积累实验数据。[研究目的](1)神经损伤后,周围CD4+T细胞迁移并浸润至脊髓中枢,通过本研究的实施,旨在阐明浸润至脊髓中枢的CD4+T细胞的具体亚群及其浸润的分子机制。(2)小胶质细胞和星形胶质细胞在NP中的作用已得到业界公认,前者与NP的产生有关,后者则在NP的维持中发挥重要作用。CD4+Th17细胞的中枢浸润处于NP的维持阶段,通过本项目的实施,探索浸润至脊髓背角的Thl7细胞与活化增殖的星形胶质细胞的相关性及其中枢敏化的可能机制。(3)带状疱疹后遗神经痛(PHN)是临床上常见的NP疾患,继发于带状疱疹病毒感染,且好发于细胞免疫功能降低的老年人,其发病似于机体的免疫功能改变密切相关。通过本研究,了解PHN患者周围免疫炎症水平及其与PHN形成的相关性；并通过观察抗中枢敏化治疗疗效,探索PHN的中枢机制,为PHN寻找免疫干预靶点。[研究方法](1)SNL大鼠模型的建立与鉴定成年雄性SD大鼠,沿L4-S1脊柱中线作一纵行切口,切除L6横突及L6～S1关节突关节,游离L5、L6周围组织,在其远端紧结扎并切断。假手术组除不结扎神经外,其余均同手术组。根据实验需要,分别于术后1、3、5、7、10、14、21天用von Frey纤毛测定大鼠左足和(或)右足机械痛阈(Up and Down方法),推算50%机械缩足阈值(50%MWT),凡术后7天50%MWT>4.0 g,即认定建模失败,排除在实验之外。(2)FACS分析脊髓浸润的CD4+T细胞暴露大鼠心脏,经主动脉灌注NS后,收集L4-L6脊髓,制备单个细胞悬液,用percoll不连续密度梯度分离方法收集脊髓中的单个核细胞,将其重悬于100μL的PBS体系中,分别加入FITC和PE标记的抗大鼠CD3、CD4抗体，4℃孵育30min，洗涤后多聚甲醛固定过夜,第二天上机检测。(3)分析脊髓背角浸润的Th17细胞依次用NS和4%多聚甲醛灌注心脏,游离L5-L6脊髓,经4%多聚甲醛固定、30%蔗糖沉底、OCT介质包埋后,制备14μm冰冻切片,免疫荧光检测Th17细胞。另取新鲜的左侧L4-L6脊髓背角组织,RT-qPCR检测脊髓中促炎因子IL-17mRNA、转录因子RORyt mRNA、趋化因子CCL2、CCL20、CXCL10 mRNA的表达情况。ELISA检测血清中IL-17、IFNγ、IL-4的含量。根据上述结果分析Th17细胞脊髓浸润及其分子机制。(4)Th17细胞中枢敏化机制研究免疫荧光分析左侧L5-6脊髓GFAP的表达情况,RT-qPCR检测L5-6脊髓背角促炎因子IL-1β、TNFα、IL-6 mRNA的含量；体外用不同浓度的IL-17刺激培养的星形胶质细胞,MTT测定星形胶质细胞的增殖情况,RT-qPCR检测星形胶质细胞促炎因子IL-1β、IL-6、TNFαmRNA的表达。结合两者的研究结果,分析Th17细胞中枢敏化机制。(5)PHN患者免疫疼痛机制及中枢干预研究采集PHN患者外周血,FACS分析T淋巴细胞亚群；ELISA检测血清中IL-12、IL-17、IFNγ、IL-4、IL-15、IL-1α的含量。硬膜外注射抗炎药物得宝松联合或不联合鞘内注射抗伤害性传导药物咪达(4)PHN组周围CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴细胞含量分别为(61.13±9.702)%、(34.2±5.388)%、(26.93±6.273)%,正常对照组分别为(66.73±6.584)%、(37.53±4.373)%、(29.2±6.002)%,PHN组虽有所下降,但并无统计学差异(P>0.05)。PHN组血清IL-17、IFNγ、IL-4、IL-12、IL-15、IL-1α的含量亦未见明显改变(P>0.05)。与基础值相比,两种不同方法的抗中枢敏化治疗均显著降低自觉疼痛与触诱发痛的VAS评分(P<0.001),得宝松联合咪达唑仑的中枢干预措施获得了更优的镇痛效果,尤其在治疗后的6-8W内。[结论](1)结扎大鼠一侧的L5、L6神经,可以成功制备神经病理性疼痛SNL模型。该模型制备的成功率高、重复性好、机械痛敏出现早且痛阈下降显著,可较好地模拟PHN患者的灼性神经痛。一侧脊神经结扎可致对侧足出现“镜像痛”现象。(2)脊神经结扎后,脊髓浸润的CD4+T细胞主要为Th17细胞,其浸润可能与脊髓背角高表达的趋化因子CCL2、CCL20相关。(3)根据体内外研究结果,首次提出Th17细胞参与中枢敏化的可能机制,即通过其产生的IL-17作用于星形胶质细胞上的IL-17R,在促进其活化增殖的基础上,使伤害性神经元信号得以其为媒介得到迅速扩展和维持；另一方面IL-17通过上调星形胶质细胞促炎因子的分泌,直接或间接增加了伤害性神经元的兴奋毒性,也导致NP的维持。此作用机制也说明了为什么短暂的Th17细胞浸润对NP会产生长期的影响。(4)PHN尽管继发于带状疱疹病毒感染,好发于老年人,但从我们的研究结果来看,PHN患者周围机体的免疫炎症状态与健康对照组相比,并未见明显改变,此结果与SNL动物模型类似,由此提示PHN患者神经与免疫的相互作用仍主要集中于损伤局部和中枢神经系统内。(5)抗炎复合抗伤害性信号传导的抗中枢敏化治疗获得了较好的疗效,由治疗结果反向证明中枢敏化在NP中占有重要地位,为进一步探索PHN的治疗方法积累了实验数据。