肝脏作为人体中最重要的器官之一,承担着合成、分泌、代谢、解毒等多种复杂的功能,各种原因一旦造成肝细胞的大量坏死,将出现肝衰竭,导致机体代谢紊乱和毒性物质的堆积,而这反过来又加重了肝细胞的损伤,影响肝细胞的再生,形成肝衰竭的恶性循环。急性肝功能衰竭(acute liver failure ALF)是指由于各种致病因素作用于机体而导致肝细胞在短时间内大量坏死或肝功能严重损害而引起的临床综合征群。临床上以黄疸迅速增加、进行性神志改变,进而发展至肝昏迷状态,并有出凝血机制异常、肝功酶学改变、肾功能衰竭甚至出现多脏器功能衰竭等为主要特点。病情进展快、病程凶险、预后差死亡率高,存活者往往直接进入肝硬化阶段。该病一般包括暴发性肝功能衰竭及亚急性肝功能衰竭。暴发性肝功能衰竭是指急性肝功能损伤,从开始发病在8周之内发展为出凝血功能异常和肝性脑病；亚急性肝功能衰竭指病人肝功能损伤从开始发病在26周内进展成为肝性脑病。当前报道的唯一具有较好效果的治疗是肝移植,存活率在50%-70%,但是由于供体的短缺和伦理学等原因,限制了肝移植的开展。基于此种前提下,国内外学者设计、构建了不同类型的人工肝系统,希冀借助一种体外的机械、理化或者生物的装置,清除患者体内蓄积的各种有害物质,补充必需物质,改善内环境,暂时替代衰竭肝脏的部分功能,为肝衰竭患者肝细胞再生及肝功能恢复创造条件,或等待供肝进行肝移植,从而降低患者病亡率。生物人工肝治疗的原理是基于肝损伤的可逆性及肝细胞的可再生性,希望通过体外辅助装置来暂时替代衰竭的肝脏功能,从而为肝移植或者肝再生赢得时间,创造条件。在临床研究中,往往因为病情复杂、影响因素多、缺乏对照而难以确切判断疗效。因此,建立理想的ALF动物模型,是进行ALF研究的基础。理想ALF动物模型的要求1974年Terblanche等提出理想ALF动物模型的5个要求,后来发展为6条,即是：可逆性、可复制性、动物死于肝衰、有治疗时间窗、大动物模型、对实验人员危害小。其中前4条要求最为重要,而后两条则有利于模型的广泛推广。在过去30年中,已发展了多种动物模型,多为急性肝衰竭(FHF)模型,方法主要包括外科手术、药物和基因敲除。目前急性肝衰竭的动物模型多数为鼠、猪及犬的模型,与临床患者临床表现、生理生化指标和病理改变差异较大。与啮齿类、犬类动物相比,非人灵长类动物(non-human primate,NHP)的生理特征以及免疫系统与人类相似,98%的基因与人类相同。构建非人灵长类动物猴ALF模型并研究其机理将为生物人工肝的临床应用提供较好的基础。研究背景：急性肝功能衰竭(acute liver failure, ALF)是临床危重疾患之一,目前的内科综合治疗效果不理想,病死率高达80%左右。当前报道的唯一具有较好效果的治疗是肝移植,存活率在50%-70%,但是由于供体的短缺和伦理学等原因,限制了肝移植的开展。因此,建立理想的ALF动物模型,是进行ALF研究的基础。1974年Terblanche等提出理想ALF动物模型的5个要求,后来发展为6条,即是：可逆性、可复制性、动物死于肝衰、有治疗时间窗、大动物模型、对实验人员危害小。其中前4条要求最为重要,而后两条则有利于模型的广泛推广。(1)可逆性：采用一定的方法使实验动物发生ALF,未经治疗的动物应该有较高的死亡率(80%左右)；而治疗有效者,肝脏病损能够可逆地恢复,动物得以存活。当前使用的一些建立模型方法,如完全阻断血供造成肝坏死和全肝切除,均造成肝脏产生不可逆性的生物化学和组织学改变,故不能建立理想的ALF动物模型。(2)可复制性：理想的ALF动物模型应该是重复性、稳定性好。目前的建立模型方法一般较难预测动物的病情程度、存活时间、昏迷时间等基本参数。另外未经治疗的ALF动物应该几乎全部死亡,但在实验工作中这一基本要求很难做到。(3)动物死于肝衰：死亡率是鉴别和观察疗效的终点指标之一。实验动物最终应该因ALF死亡而不是死于其它原因,这一点对于准确采集实验数据,正确判定疗效非常重要。(4)有治疗时间窗：从对动物施加损害性处理到动物死亡的时间间隔不应该太短,以便有足够的时间对其进行干预并评估治疗效果。(5)大动物模型：大动物的ALF模型便于连续地采集血样或组织进行系列性研究,所研究的各种治疗方法也希望在与人近似的动物上进行实验以便以后直接应用于临床,如当前对生物人工肝支持系统的研究以使用大动物模型为宜。(6)对实验人员危害小：所应用的任何化学品应该尽量对实验人员无害。但目前使用的某些肝毒性物质,如四氯化碳、亚硝基胺等,由于对人体有一定毒性未能达到此项要求。目前的急性肝功能衰竭动物模型多是鼠、猪、犬类。与啮齿类、犬类动物相比,非人灵长类动物(non-human primate,NHP)的生理特征以及免疫系统与人类相似,98%的基因与人类相同,目前通过检索国内外文献还未见非人灵长类动物急性肝功能衰竭模型的报道。因此探索和建立与人类相似猴ALF模型就十分必要。目的：构建一种稳定的具有潜在可逆性和良好重复性的非人灵长类大动物急性肝衰竭模型,为了解人ALF的机制和救治建立基础。本研究拟在氯胺酮(0.1 ml/kg)麻醉条件下,通过静脉注射不同剂量的D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-gal)以建立食蟹猴ALF模型,观察动物的临床、生化及组织学变化特征,摸索猴ALF合适的D-gal剂量,为下一步探索急性肝功能衰竭的机制及救治奠定基础。材料和方法：选取雄性食蟹猴作为模型动物。预实验后将20只食蟹猴随机分为4组：第一组为大剂量组(n=5),给药剂量为0.45g／kg；第二组为中等剂量组(n=5),给药剂量为0.3g／kg；第三组为低剂量组(n=5),给予D-氨基半乳糖0.15g／kg第四组为对照组(n=5),不给予D-氨基半乳糖。氯胺酮(0.1 ml／kg)肌内注射麻醉下,在10 min内把D-氨基半乳糖溶液经颈外静脉一次性输入实验猴体内。颅顶钻一小洞,插入Codman微传感器测量颅内压(ICP)的变化。术后动态观察生存情况,术前及术后每天定时抽血送南方医院检验科,用于测定肝功能、肾功能、血糖、血氨、凝血项、支链氨基酸和芳香族氨基酸比等。观察动物临床表现及病程进展情况,记录动物存活时间。死亡动物立即尸检,动物死后作详细尸检并取肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、心脏、肺、胃肠和脑组织。光镜标本均用10%的甲醛溶液固定,石蜡包埋切片,HE染色,电镜标本经戊二醛和锇酸双重固定,树脂包埋,醋酸铀、柠檬酸铅染色,光镜及电镜下观察上述组织的病理学变化。结果：第1组的平均存活时间是(56.1＋8.1)h,有4／5的病食蟹猴死亡前出现肝昏迷,不能站立。第2组的平均存活时间为(109.8±11.2)h,其中3／5的病食蟹猴出现肝昏迷。第3组以剂量为0.15g/kg D-氨基半乳糖胺引导的5只食蟹猴中,除1只98h后死亡外其余全部存活,在第4d开始好转,之后全部指标渐恢复正常。第2组两只食蟹猴的存活时间分别为105和120 h,食蟹猴的血压在给药后都保持平稳,颅内压则明显上升1倍以上,血清的转氨酶在给药后12h开始升高,并随病程进展越来越高,血中的胆红素、胆酸、氨、乳酸也逐渐上升。而血小板则越来越低,凝血酶原时间越来越长。所有实验食蟹猴的血液电解质和酸碱度一直保持在正常的范围内。血气分析的结果也在正常范围,没有明显的变化。直线相关分析显示注射D-gal的动物存活时间与D-gal剂量呈显著负相关。Kaplan-Meier生存分析表明各组实验猴生存时间比较,(x2=21.933，P=0.000)差异有显著性。尸检发现所有给予D-gal的动物肝脏体积缩小,边缘变锐,表面色泽斑驳,散在针尖至米粒大小出血点,肝脏切面有暗红色淤血,黄色乳靡状坏死物质溢出,胆囊形态、大小正常,肠管有轻度到中度胀气,肠壁充血水肿,有散在出血点,肾脏、脾脏、肺脏肉眼未见异常。脑组织重度水肿,以血管周围间隙与星状细胞周围明显。光镜检查发现对照组动物肝小叶结构完整,无肝细胞坏死征象。而注射D-gal的动物均出现肝细胞片状坏死,伴有明显的出血,肝细胞弥漫性肿胀,肝窦受压变窄。肝细胞胞浆疏松化、空泡变性,部分肝细胞内可见脂肪空泡。部分肝细胞核碎裂、溶解。部分汇管区可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润。0.45g/kg的动物肝细胞呈现大片坏死,肝小叶结构不清,出血严重。电镜检查未注射D-氨基半乳糖胺时,肝脏超微结构示食蟹猴肝细胞胞浆内糖原颗粒丰富,内质网丰富无扩张,线粒体丰富无肿胀,嵴清晰,线粒体膜清楚,细胞核染色质均匀,核膜核仁清晰。注射D-氨基半乳糖胺时,细胞浆内糖原颗粒均质化,粗面内质网脱颗粒,线粒体肿胀,嵴模糊,部分线粒体溶解,细胞间毛细胆管微绒毛减少明显,细胞核染色质集聚,核变形,核内假包涵体形成。结论：1.成功建立了D-gal诱导的ALF模型及摸索出最佳药物剂量；2.D-gal诱导的食蟹猴ALF模型具有与人类ALF相似的临床、生化和病理学特征。3.D-gal诱导的食蟹猴ALF模型具有潜在可逆性和良好的重复性,动物死于ALF,且具有合适的治疗时间“窗口”,适合应用于人工肝临床前评价研究。