论文部分内容阅读
第一部分体外预诱导软骨块的培养和鉴定研究目的:分离和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞,并且在体外制备预诱导软骨块。材料与方法:利用全骨髓贴壁法分离原代C57BL/6小鼠的骨髓来源间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),培养至第三代,通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)鉴定其干细胞特征性表面标志的表达情况,利用对应诱导培养基对细胞进行成骨、成脂向分化,并通过茜素红和油红O染色进行鉴定;随后将第三代BMSCs接种至商用明胶海绵(Spongostan○R)(10~6细胞/个),经过一周的增殖培养基和四周的软骨块诱导培养基培养后,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测肥大软骨细胞特征性标志,并通过Safranin O染色观察软骨块切片。实验结果:流式细胞术结果显示本研究分离的小鼠BMSCs特征性高表达CD44、CD29和Sca-1,同时基本不表达造血系细胞标志CD31和CD34;成骨诱导培养后茜素红染色可见深红色钙化结节,成脂肪诱导培养后油红O染色可见红色的胞内脂滴形成;将BMSCs接种到明胶海绵并经成软骨诱导后,形成呈半透明状并有一定厚度和弧度的“软骨块”,并高表达肥大软骨细胞的特征性标志物II型胶原(collagen II,COLII),聚蛋白多糖(aggrecan,Acan)以及Y染色体性别决定基因相关高移动框转录因子9(SRY-related high mobility group-box gene9,Sox9),番红O(Safranine O)染色可见“陷窝状”软骨细胞形态。结论:本研究分离得到稳定的小鼠骨髓间充质干细胞,并且可以在体外预制备成“软骨块”。第二部分清除受体小鼠的单核/巨噬细胞对软骨块皮下成骨成血管的影响研究目的:检测清除受体小鼠的单核/巨噬细胞对软骨块在其皮下成骨成血管的影响,以明确巨噬细胞在该过程中的参与。材料与方法:利用尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体(clodronate liposomes)(每三天一次)的方法清除小鼠外周血中的单核细胞,以减少趋化至皮下植入部位的巨噬细胞,以磷酸盐缓冲液脂质体(PBS liposomes)作为对照,用流式细胞术鉴定清除效率;将同一批制成的软骨块分别植入上述两组不同处理的小鼠的皮下,通过微计算机断层扫描(microcomputer tomography,?-CT)和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)染色从影像学和组织学角度比较两组的皮下成骨成血管效应。实验结果:对小鼠外周血的流式细胞术结果显示,clodronate liposomes处理后的小鼠外周血中CD3~-CD45RA~-F4/80~+CD11b~+单核细胞数量明显减少,随后趋化至植入部位的巨噬细胞数量也会降低;?-CT扫描结果显示,骨体积分数(bone volume/total volume,BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)和骨矿物质密度(bone mineral density,BMD)的数值在clodronate组都比PBS组要降低,说明成骨量降低,而结构模型指数(structure model index,SMI)、骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor,Tb.Pf)及各向异性的程度(degree of anisotropy,DA)的数值在clodronate组都比PBS组要升高,说明骨小梁更疏松;IHC染色结果也显示,clodronate处理小鼠后使植入物中的成骨标志物骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)以及血管内皮标志物CD31的表达量都降低。结论:减少小鼠的单核/巨噬细胞数量使软骨块在其皮下的成骨效应和成血管进程受到抑制,证实软骨块皮下成骨成血管需要单核/巨噬细胞的参与。第三部分软骨块植入正常小鼠后趋化的巨噬细胞的M2/M1表型变化研究目的:追溯在软骨块皮下成骨过程中,软骨块对趋化而至的巨噬细胞的表型的影响。材料与方法:将软骨块和空材料分别植入正常小鼠的皮下,在第三天和第七天取出植入物,利用胶原酶和胰蛋白酶(0.5ml:0.5ml)将其中的细胞消化成单细胞悬液后,加入PE荧光标记的抗F4/80流式抗体、APC荧光标记的抗CD86流式抗体和PerCP/Cy5.5荧光标记的抗CD206流式抗体,进行流式细胞术检测,比较两组中II型巨噬细胞(M2)和I型巨噬细胞(M1)的比例,以观察在该过程中巨噬细胞的表型变化趋势。实验结果:在炎症初期的第三天和成骨过程开始的第七天时,软骨块中的巨噬细胞的M2/M1比例都显著高于空材料对照组;而在软骨块中,第七天的M2/M1的比例也显著高于第三天,提示软骨块植入后使巨噬细胞中的M2表型的占比呈增长趋势。结论:软骨块植入皮下后,在免疫反应的初期和骨生成开始的阶段,软骨块可以促进趋化而至的巨噬细胞向促进修复的II型表型极化,提示软骨块具有良好的免疫调节能力。第四部分软骨块与巨噬细胞相互作用的体外研究研究目的:通过体外细胞学实验进一步研究检测软骨块对巨噬细胞极化的影响和机制,以及极化的巨噬细胞对软骨块的成骨成血管标志物表达的影响。材料与方法:利用transwell将巨噬细胞系RAW264.7细胞与软骨块共培养,首先,将RAW264.7细胞以5?10~5个/孔的密度接种于transwell下层,上层分别加入无菌的spongostan,5?10~5个第三代BMSCs,1个软骨块,进行共培养,通过流式细胞术检测巨噬细胞的极化情况,蛋白质印迹实验(western blot,WB)检测细胞中信号传导及转录激活因子(Signal transducer and activator of transcription,STAT)-1/3/6的磷酸化情况;用含1?g/ml的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和10ng/ml干扰素?(interferon?,IFN-?)的细胞培养基培养RAW264.7细胞24小时,得到M1型巨噬细胞;用含10ng/ml白介素4(interleukin 4,IL-4)的细胞培养基培养RAW264.7细胞24小时,得到M2型巨噬细胞;不含任何添加物的培养基的细胞认为是M0巨噬细胞,作为对照;将一个软骨块置于transwell上层,下层分别接种刚极化的M0、M1和M2细胞(5?10~5个/孔),进行共培养48小时,利用qRT-PCR检测软骨块中成骨成血管标志物的表达情况。实验结果:流式细胞术结果显示,BMSCs和软骨块都能促进巨噬细胞向M2向极化而抑制其向M1向极化,而软骨块的作用比BMSCs更强烈;蛋白印迹实验结果提示,该现象的原因可能是软骨块比BMSCs使STAT3的磷酸化程度更高而STAT1的磷酸化程度更低;qRT-PCR结果显示,M1和M2都可以不同程度地增强骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、成骨相关转录因子(runt-related transcription factor 2,Runx2)、I型胶原(collagen I,COLI)以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。结论:体外细胞学实验进一步明确软骨块促巨噬细胞M2向极化而抑制其M1向极化,而两种表型的巨噬细胞都可以不同程度地促进软骨块成骨成血管进程。