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反刍动物瘤胃产生的甲烷不仅加剧温室效应,而且浪费了2%～15%的饲料总能。研究显示,在日粮中添加硝酸盐能有效降低瘤胃甲烷排放。硝酸盐不仅可与产甲烷菌竞争还原氢而显著降低甲烷的产量,而且为反刍动物提供非蛋白氮。但添加硝酸盐易造成反刍动物瘤胃及机体亚硝酸盐中毒,目前还没有解决这一问题的有效措施。研究发现,在淡水淤泥等环境中存在亚硝酸盐依赖型甲烷氧化菌（NC10门细菌）,这类菌一方面可以利用甲烷,另一方面可以将亚硝酸盐还原。在前期工作中,我们发现反刍动物瘤胃液中存在NC10门细菌,但在以甲烷为唯一碳源,硝酸盐为电子受体的富集过程中并未检测到NC10门细菌,预示瘤胃中可能存在其他类型能更有效利用甲烷和亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化菌。试验一瘤胃液亚硝酸盐依赖型甲烷氧化菌多样性研究为了检测瘤胃液中能够进行亚硝酸盐依赖厌氧甲烷氧化（N-DAMO）代谢的微生物,本试验建立了以奶山羊瘤胃液接种物、甲烷为唯一碳源、亚硝酸钠为电子受体的富集培养体系,并用16S r DNA高通量测序方法检测瘤胃液和富集培养物中的微生物结构及多样性。结果显示,经过6个月的富集培养,抑制了拟杆菌门和厚壁菌门的细菌生长,促进变形菌门和放线菌门的细菌增殖,且变形菌门成为N-DAMO富集培养系统中的最主要的菌门,铜绿假单胞菌成为优势菌种。试验二铜绿假单胞菌NWAFUP1分离鉴定及功能验证在试验一的基础上,通过传统的分离纯培养技术分离培养富集培养体系中的优势单菌株。形态学和分子生物学鉴定显示,被分离的菌株为N-DAMO富集培养体系中的优势OTU,即铜绿假单胞菌,并将其命名为铜绿假单胞菌NWAFUP1。随后将其接种到含有CH4和4 m M KNO3或2 m M Na NO2的厌氧环境中,采用同位素(13CH4、K15NO3、Na15NO2)示踪技术检测其是否能够进行厌氧甲烷氧化。并在培养初期加入2%O2或添加40 m M乙酸盐-10 m M丙酸盐,以探究氧气与其它碳源对铜绿假单胞菌NWAFUP1的DAMO功能影响。结果表明,铜绿假单胞菌NWAFUP1可以独立完成反硝化型厌氧甲烷氧化（DAMO）过程（P<0.05）。2%O2和乙酸盐-丙酸盐对铜绿假单胞菌NWAFUP1的DAMO功能有不同程度的影响,但并不会导致其DAMO功能的消失。试验三体外添加铜绿假单胞菌NWAFUP1、硝酸盐对瘤胃发酵的影响试验分别添加10 mmol/L KNO3、铜绿假单胞菌NWAFUP1以及两者共同添加,以研究体外添加铜绿假单胞菌NWAFUP1对补充硝酸盐导致的瘤胃亚硝酸盐蓄积、发酵性能及甲烷排放的影响。结果表明,添加铜绿假单胞菌NWAFUP1可显著减少甲烷排放（P<0.05）,与单独添加硝酸盐相比,两者共同添加可显著提高中性洗涤纤维降解率、酸性洗涤纤维降解率、异丁酸浓度、异戊酸浓度和发酵效率（P<0.05）,显著降低氨态氮浓度（P<0.05）,缓解由于添加硝酸盐而导致的亚硝酸盐蓄积和丙酸合成抑制（P<0.1）问题。综上所述,在以甲烷为唯一碳源,亚硝酸盐为电子受体的瘤胃富集培养体系中,优势OTU为铜绿假单胞菌,其可以利用甲烷为唯一碳源,硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体将甲烷氧化为二氧化碳,硝酸盐和亚硝酸盐还原为氮气。此外,在2%O2和乙酸盐-丙酸盐存在的条件下,铜绿假单胞菌依然具有依赖硝酸盐的厌氧甲烷氧化功能。在体外瘤胃液体系中添加铜绿假单胞菌,不仅以减少发酵体系中甲烷的排放,而且可缓解由于添加硝酸盐而导致的亚硝酸盐蓄积和丙酸合成抑制问题。