目前,我国临床使用的血液制品有19种,包括全血、红细胞、血小板、粒细胞等,为了确保上述血液制品的安全性,国家出台了相关标准,规范了血液采集、制备、储存等相关质量要求和监测指标,这些标准规定的多为功能性、物理性、细胞和分子层面指标,如血小板质量监测标准内容包括标签、外观、容量、储存期末pH、血小板含量、白细胞混入量（残留量）、红细胞混入量、无菌试验等。标准的有效实施保障了临床用血的有效性和安全性,但战时输血救治的环境恶劣,且血液的采集、保存和运输条件与平时有所差异,因而对血液安全与保障提出更高的要求,亟需对血液质量进行更为精准的评估,有必要在现有标准基础上,利用现代生物科技新技术,发现基于分子层面的血液质量监测新指标并研究其功能,以保障战伤救治的有效性和安全性。输血在战伤救治中发挥不可替代的作用,然而血液在采集、储存和运输过程中面对的体外条件和体内截然不同,血液受到外界物理和化学因素影响后,其新陈代谢、生化反应等都异于体内,细胞膜的完整性及功能也会发生变化,如红细胞变形性和携氧能力下降、血小板活化、凝血因子功能下降等,输注这些变化严重的血液成分进入体内可能会导致组织供氧不足、血小板输注无效、止血效果不佳或者引发炎症反应,影响救治效果,严重的则可使伤员存活率下降,导致军队战斗力下降。在众多血液制品中,20～24℃震荡保存的血小板易污染、保存期短,尽管采取了4℃、-80℃等低温保存方式达到延长血小板保存期限的目的,但是低温保存的血小板活化程度更高、在体内易被清除,因此,了解血小板活化的内部调控分子机制是实现血小板质量精准评估、解决血小板储存损伤问题的关键因素之一。血小板是由巨核细胞产生的无核血细胞[1],被巨核细胞前体释放后进入血流并循环7-10天,然后在脾脏和肝脏中被清除[2],是生理止血过程中的效应细胞,在病理性血栓形成中起着核心作用。血小板中保留了巨核细胞来源的内质网、线粒体、自噬体（autophagosomes）、核内体（endosomes）、溶酶体等细胞器和血小板特异性的致密颗粒和α颗粒等;也含有大量不同类型的RNA,巨核细胞在血小板生成过程中通过特异性调控将编码和非编码RNA分选至血小板[3]。尽管血小板是无核的,但其具备处理RNA转录产物的多种途径、特异性的翻译机制以及响应不同激活信号而合成不同的蛋白质的能力[4]。血小板在体外储存过程中会发生形态改变和功能受损（血小板储存损伤）,同时也能分泌大量的细胞外囊泡（platelet extracellular vesicles,P-EVs）,研究认为血小板源细胞外囊泡是血小板在活化、凋亡和破坏时释放出来的具有促凝活性的直径为30-1000 nm的囊状小泡。另外有研究表明,血小板浓缩物中的细胞外囊泡的含量随着储存时间的延长而增加。血液存储期间分泌P-EVs中携带的生物分子可提供血小板存储后的相关质量信息,具备做为生物标志物的潜质。血小板的主要作用是在血管内维持止血及血管完整性,其不能跨越组织屏障,而P-EVs不仅包含了血小板中的脂质、蛋白质、核酸等,而且可以进入淋巴、骨髓、滑膜液甚至穿越生物屏障,这使得血小板来源的物质可以随EVs转移到血小板无法到达的地方[5],这些内含物在P-EVs被靶细胞摄取后仍可发挥相应的功能,从而完成细胞间的物质（蛋白质等）和信息（核酸）传递,维持机体生理状态,参与机体病理进程。P-EVs中非编码RNA含量丰富,非编码RNA可参与细胞增殖、分化、凋亡、感染以及免疫应答等几乎所有生理或病理过程的调控[6]。目前针对P-EVs中的非编码RNA成分和功能的研究目前还较少,P-EVs在机体免疫调节以及肿瘤发展中是否可通过非编码RNA发挥调控作用也需要探索。研究目的:我们期望通过研究血小板在储存阶段生成的细胞外囊泡的功能及其内含非编码RNA成份的变化规律,筛选出与血小板质量变化密切相关的非编码RNA,为血小板的质量评价提供分子水平的标志物。另外,通过开展体外的相关功能实验,明确P-EVs对免疫细胞功能的影响并进一步探索其分子机制。研究内容及结果:1.P-EVs的提取和鉴定利用尺寸排阻超滤方法提取P-EVs,电镜和纳米颗粒跟踪分析技术检测其形态和粒径分布。TEM和NTA分析表明,分离获得的的P-EVs呈碗状结构,粒径主峰主要出现在74nm处,占比88.3%。Western Blot结果显示所提取的P-EVs表达细胞外囊泡特异蛋白CD9以及血小板活化的蛋白CD62p。2.P-EVs中ncRNA表达谱的检测分析利用二代测序技术检测P-EVs中的非编码RNA成分,包括lncRNA、miRNA、以及circRNA。对差异非编码RNA的靶基因进行生物信息学分析,初步筛选出与血小板活化密切相关的lncRNA MSTRG.31496.1。3.P-EVs对M2型巨噬细胞的功能影响及目标RNA筛选体外利用PMA诱导THP-1分化获得M2型巨噬细胞,将P-EVs与M2型巨噬细胞共培养后,发现巨噬细胞的凋亡率上调,增殖率下调,且巨噬细胞凋亡率与P-EVs剂量呈正相关。测序技术结合生物信息学分析方法研究其可能的作用机理,结果表明在与P-EVs共培养后,巨噬细胞中有396个lncRNA的上调、719个lncRNA的下调;采用Tophat2/Hisat2/STAR软件对RNA-Seq测序数据进行比对分析,在顺式调控分析中筛选出了 P-EVs中可能参与调控巨噬细胞凋亡的LncRNA MIR4435-2HG。4.MIR4435-2HG的作用机制研究通过RACE实验获取了 lncRNA MIR4425-2HG序列全长,通过RNA-FISH、qRT-PCR对lncRNA MIR4435-2HG进行亚细胞定位,结果显示lncRNA MIR4435-2HG主要分布在细胞质中。通过构建过表达载体并进行功能验证,发现lncRNA MIR4435-2HG与其预测的靶基因BCL2L11 mRNA表达水平之间正向相关。通过生物信息学进一步分析发现EIF3G蛋白同时连接MIR4435-2HG以及BCL2L11 mRNA,采用RNA pull-down及RIP实验对预测分析结果进行验证。对MIR4435-2HG上功能区域敲除后,BCL2L11 mRNA的表达下调。研究结论:LncRNAMSTRG.31496.1和血小板活化密切相关,是潜在的可用于血小板质量评价的分子水平的生物标志物。血小板分泌的P-EVs中的LncRNA与免疫调节密切相关,现有研究结果表明P-EVs中的lncRNAMIR4435-2HG可增加BCL2L11 mRNA的稳定性,从而负向调控M2型巨噬细胞增殖。