本研究旨在为急性脊髓损伤探索一种新的治疗策略——自聚合肽纳米纤维材料(self-assembling peptide nanofiber scaffold, SAPNS)联合RhoA抑制剂(RhoA inhibitor CT04)促进脊髓损伤的修复。目前为止关于脊髓损伤的实验改性治疗方案有很多,如手术治疗,物理治疗,中医治疗,药物治疗,移植治疗等,这些治疗方法于一定程度上促进了脊髓损伤动物后肢功能的恢复。然而需要考虑的是伦理道德方面的局限、抑制因子清除的不彻底、移植物来源的狭窄以及治疗方案的单一性使其难以有效彻底的针对诸多不利因素等,这些困难成为治疗脊髓损伤修复的瓶颈问题。因此,探索新型的生物材料和新的治疗方法避免以上问题,为临床提供一种更具可行性的治疗,成为近年来研究脊髓损伤修复方面的热点,各种新型的生物材料和新方法随之涌现出来。SAPNS是近年来研究出来的一新型纳米纤维材料,至今为止已有报道证实它能够在组织修复中发挥良好的作用,被认为是组织损伤修复研究中比较具有应用前景的生物材料之一。相比其他生物材料,它在组织损伤修复的研究中具有以下各项优势：①良好的组织相容性：不会因相邻组织的排异反应而影响新组织的结构功能。②良好的生物降解性：生物材料在完成支架的作用后应能充分降解,降解产物能够被组织吸收,降解率应基本与组织细胞的生长率相适应。③具有三维结构：纳米材料可形成三维立体结构,这种结构可提供更大的空间,利于细胞外基质的沉积、营养物质和O2的进入、代谢产物的排出,更有利于再生神经的长入。④可塑性：由于其胶冻状的特性,移植到体内后能随着损伤区的大小改变其形态,更好的契合损伤腔。⑤不会引起明显的免疫排斥反应和炎症反应,能将携带生物致病源和污染的风险降到最低,无细胞毒性。SAPNS能很好的修复中枢神经损伤区及促进神经再生。并且具有良好的缓释作用,可作为缓释材料在损伤区给药。现今的各种研究都表明RhoA在脊髓损伤修复中具有关键性的意义。RhoA是隶属于Ras超家族的一种小分子GTPase,以结合GDP(无活性)和GTP(有活性)的形式发挥主要的分子开关作用,是所有真核细胞细胞骨架肌动蛋白的调节因子。在神经系统的发育阶段,它的表达能够促进神经元的迁移和突起的生长,而在成熟神经元中几乎不表达。当神经元损伤后1-3d, RhoA表达开始轻微升高,1w达到高峰,可持续表达3w以上,并且能被激活。研究发现RhoA在神经元受损后的重新高表达以及激活是中枢神经再生困难的重要原因之一。目前已知的抑制中枢神经再生的相关因子大部分通过激活其下游的Rho信号通路而发挥作用。脊髓损伤后RhoA的重新高表达及其激活可导致轴突生长锥的塌陷,从而使受损神经元凋亡,这是导致脊髓损伤后中枢神经再生困难的最主要原因。因此,设法降低受损神经元的RhoA表达或抑制其激活就有可能为促进脊髓损伤修复提供一个新的治疗方法。RhoA抑制剂CT04能有效的把高表达RhoA从有活性的GTP形式逆转化成无活性的GDP形式,从而使损伤后高表达的RhoA失去活性后无法发挥其抑制轴突生长的作用。目前,已有不少关于使用RhoA抑制剂的报道。其中对中枢神经使用的方法主要有2种：即局部微量注射和静脉注射。然而局部的微量注射会使神经组织受到二次损伤,静脉注射则用药量大且很难避免全身副作用。因此迫切需要探索一种更加可行的用药方法。本研究在建立脊髓全横断损伤模型的基础上,于损伤处移植含有RhoA抑制剂CT04和SAPNS的复合材料,针对前述的中枢神经修复困难各种复杂因素,以期望在修复脊髓损伤处的同时缓释CT04,抑制高表达RhoA的激活,从而探索出一种相对修复脊髓损伤后结构与功能的新方法。本研究可分为两个部分。第一部分：脊髓损伤模型的建立以及移植材料的构建和移植。昆明小鼠,雌性,74只,12周龄,30-35g；动物的分组和每组数：假手术组(sham)12只,生理盐水组(saline)20只SAPNS组20只,SAPNS+CT04组20只,另2只用于移植SAPNS+Dextraran。取一管RhoA抑制剂(CT04),把粉末状于10000转／5min高速离心后加20μl50%甘油,配成浓度为1μg/μl,利用吹打及震荡的方法充分溶解,后用8000转／3min高速离心,无菌环境下分装每瓶2μl,于-20度冻存。每次取2μlCT04以及13μlAPNS,于干净的培养皿中迅速均匀混合。后置于DMEM/F12(1:1)培养基溶液中室温下孵化10m in,使SAPNS充分凝固,SAPNS组的材料则用2μl的50%甘’油替代CT04,其他步骤同上,移植材料共15μ1。整个操作在相对无菌条件下进行。实验组昆明小鼠,用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,剂量为30mg/kg。Sham组在麻醉后于小鼠背侧T8-10位置打开锥板,仅仅暴露脊髓。其他各组则需要在暴露同一位置脊髓后进一步用显微手术剪剪开硬脊膜,于T9位置垂直切除长度为1mm的一段脊髓,完全掏空损伤腔。SAPNS+CT04组,SAPNS组和saline组分别在切除脊髓后形成的损伤腔内填充上述构建的移植材料或者等量15μl的生理盐水,然后逐层缝合。移植入SAPNS+Dextran的2只小鼠在手术后1w取材,取材部位脊髓为T6-11,后做冰冻切片,在荧光显微镜下观察并拍照,记录Dextran进入脊髓神经元的情况。结果显示,Dextral虽大部分仍集中在损伤区,但是也有一部分顺利被脊髓神经元轴突摄取。由此可以得出结论,SAPNS能够作为一个桥梁对其中所混的化学物质进入损伤脊髓具有缓释作用。对各移植组动物12w后进行灌注固定切片,各组随机抽取几张做HE染色,镜下观察SAPNS与宿主的组织相容性及其对损伤脊髓结构的修复效果。结果显示,生理盐水组存在较大的损伤区空洞,而SAPNS组和CT04+SAPNS组宿主与移植物衔接良好,无明显空腔。第二部分：脊髓损伤的修复效果评定。对实验所得计量资料电生理的潜伏期和峰峰值、轴突密度、ED1细胞数量、TUNEL细胞数量使用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA); BMS评分值用1w用两个样本的T检验,6w和12w用单因素方差分析(One-Way ANOVA)手术后1w、6w、12w对剩下小鼠进行爬网格测验和BMS评定。各组各取5只小鼠12w后在横断处远端注射荧光金(FG)再存活7d,Sham组取5只,其他各取8只小鼠12w后测皮质运动诱发电位(CMEP)然后取材、切片并进行形态学观测。结果显示：1.移植物能够促进脊髓横断处结构修复和后肢功能的恢复；2.各移植组与实验对照组相比,脊髓损伤区近端、脑干红核及大脑躯体感觉运动皮质内锥体细胞层有少量的FG标记神经元,其中CT04+SAPNS组的FG标记神经元多于单纯SAPNS移植组；3.各移植组与实验对照组相比,CMEP的潜伏期减小,峰峰值增大；4.各移植组与实验对照组相比,在损伤区附近的胶质瘢痕细胞、炎症细胞、凋亡细胞明显减少；5.CT04与SAPNS联合抑制能抑制RhoA的活性,与单纯SAPNS相比,损伤区内轴突的生长率高,因此CT04+SAPNS组小鼠功能恢复好于其余组,组间差异有统计学意义。