菊花CmMYBs基因克隆及其抗蚜性功能鉴定

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菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)原产我国,是世界四大切花与我国十大名花之一,观赏与经济价值极高。蚜虫是菊花最重要的害虫,严重影响菊花的产量与品质。目前,蚜虫防治多采用化学方法,不仅消耗了大量人力物力,对环境造成污染,而且农药的残留使得蚜虫群体产生抗药性。蚜虫的防治已成为菊花生产中的一大难题。MYB转录因子功能众多,参与到植物的各种生命活动中,已有报道MYB转录因子参与植株抗蚜虫过程中的调节。然而在菊花中,关于MYB基因抗蚜性的研究尚未见报道。本文从菊花中克隆得到了两个MYB基因CmMYB58.1、CmMYB58.2,并对其表达特性、转录激活活性及亚细胞定位等进行了研究;通过农杆菌介导的叶盘转化法将其转化菊花‘神马’,获得了超表达植株,并对其抗蚜性进行了鉴定;通过对转基因株系的木质素合成相关基因表达量的分析,初步探究了MYB基因的抗蚜性机制。主要研究结果如下:  1.采用RT-PCR和RACE-PCR技术,从菊花中克隆得到2个菊花MYB基因CmMYB58.1和CmMYB58.2。经序列分析,CmMYB58.1基因的ORF为753bp,编码251个氨基酸;而CmMYB58.2基因的ORF为600bp,编码200个氨基酸,基因登录号分别为KT763374和KT763375。序列分析及氨基酸同源性比对表明,这两个基因均含有两个保守的MYB结构域,属于典型的R2R3-MYB转录因子。  2.菊花植株接种蚜虫后的荧光定量PCR结果显示,两个基因对蚜虫的响应模式均有其特性,且不同于机械伤处理。不同组织器官的荧光定量PCR结果表明CmMYB58.1和CmMYB58.2的表达均有组织特异性,在叶片中表达量最高,茎中次之,根中表达量最少。  3.构建了酵母效应质粒pGBKT7-CmMYB58.1和pGBKT7-CmMYB58.2,酵母单杂交试验表明,CmMYB58.1具有转录激活活性,且在添加了X-α-gal的SD/-His-Ade培养基上显蓝色,而CmMYB58.2没有转录激活活性或有极微弱的转录激活活性。  4.构建了绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pMDC43-GFP-CmMYB58.1和pMDC43-GFP-CmMYB58.2,亚细胞定位试验表明CmMYB58.1和CmMYB58.2均定位于细胞核上。  5.通过农杆菌介导的叶盘侵染法,将CmMYB58.1和CmMYB58.2导入菊花感蚜品种‘神马’中,对获得的超表达株系的抗蚜性鉴定表明,CmMYB58.1和CmMYB58.2均能提高菊花的抗蚜性。两个基因超表达株系中木质素的生物合成均增加,CmMYB58.1超表达株系中的Cm4CL1(4-香豆酸CoA连接酶)、CmCCR1、CmF5H1(阿魏酸-5-羟基化酶)和CmCAD6(肉桂醇脱氢酶)比对照植株均有明显的升高,而CmC4H和CmCOMT(咖啡酸-O-甲基转移酶)的表达量比对照植株却有所下降;CmMYB58.2超表达株系中的CmPAL1(苯丙氨酸氨基裂解酶)、CmC4H(肉桂酸-4-羟基化酶)、Cm4CL1(4-香豆酸辅酶A连接酶)、CmHCT(羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶)、CmC3H1(香豆酸-3-羟基化酶)、CmCCoAOMT1(咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶)以及CmCCR1(肉桂酰CoA还原酶)表达量均有明显的升高,而其他相关基因表达量的升高不显著。表明CmMYB58.1和CmMYB58.2可通过促进木质素的积累来提高植株的抗蚜性。
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