芹菜素对人胃癌细胞多药耐药性的影响及其机制

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胃癌是常见的恶性肿瘤之一,肿瘤的多药耐药性是当前胃癌治疗的主要障碍。现有多药耐药性逆转药物由于作用机制单一、选择性差、副作用大等缺点,临床治疗效果不佳。因此,寻找低毒、有效、作用靶点广泛的治疗肿瘤多药耐药性的方法意义重大。芹菜素是天然黄酮类化合物,能通过多种机制抑制肿瘤,并具有天然、低毒、高效的特点,临床应用前景广阔。近期文献显示,芹菜素调节肿瘤细胞MRP1的转运功能及其ATP酶的活性,促进GSH转运至细胞外。芹菜素二聚体衍生物竞争抑制肿瘤细胞内P-gp介导的药物外排,增加化疗药物敏感性。因此,芹菜素可能具有治疗和逆转胃癌细胞多药耐药性的作用。本课题通过细胞培养、MTT、FACS、PCR、Westernblot等方法对芹菜素对胃癌多药耐药细胞生长增殖和多药耐药性的影响进行研究,并进一步探讨其作用与MDR1基因及其表达产物P-gp的关系,从而为阐明芹菜素逆转肿瘤多药耐药性的分子机制及其在胃癌治疗及MDR逆转中的应用提供重要的理论依据和实验基础。【目的】1.研究芹菜素对胃癌多药耐药细胞生长增殖的影响;2.观察芹菜素对胃癌多药耐药细胞的化疗药物敏感性与药物转运功能的影响;3.探讨芹菜素抑制胃癌多药耐药细胞生长和逆转胃癌细胞多药耐药性的分子机制;4.研究芹菜素对化疗药物抗胃癌作用的影响与机制。【方法】1.采用MTT法绘制细胞生长曲线,观察芹菜素对胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR的生长的影响;2.采用PI染色法,流式细胞术检测芹菜素对SGC7901/VCR细胞周期分布的影响;3.采用Annexin V/PI染色法,流式细胞术检测芹菜素对SGC7901/VCR细胞凋亡状态的影响;4.采用MTT法进行体外药物敏感性分析,观察芹菜素对SGC7901/VCR细胞药物敏感性的影响;5.采用诺丹明外排实验检测芹菜素对SGC7901/VCR细胞膜的药物转运功能的影响;6.采用Western blot方法检测芹菜素对SGC7901/VCR细胞内P-gp蛋白的表达的影响;7.采用Real-time PCR检测芹菜素对SGC7901/VCR细胞内多药耐药基因MDR1的转录的影响;8.采用PI染色法,流式细胞术检测芹菜素和阿霉素联合应用对SGC7901/VCR细胞周期分布的影响;9.采用Annexin V/PI染色法,流式细胞术检测芹菜素和阿霉素联合应用对SGC7901/VCR细胞凋亡的影响;10.采用Real-time PCR技术芹菜素和阿霉素联合作用SGC7901/VCR后抑癌基因p53、p21的表达变化。【结果】1.细胞生长曲线显示:与对照和长春新碱相比,芹菜素可显著抑制SGC7901/VCR细胞的生长;2. PI染色法,流式细胞术检测细胞周期分布显示:芹菜素处理SGC7901/VCR细胞后,G1期细胞含量减少,S期和G2期细胞含量增加,部分细胞出现凋亡峰;3. Annexin V/PI染色法,流式细胞仪检测细胞凋亡显示:芹菜素可诱导SGC7901/VCR细胞的细胞凋亡;4. MTT法分析细胞体外药物敏感性显示: SGC7901/VCR对芹菜素的作用敏感,并且芹菜素能增强SGC7901/VCR对化疗药物敏感性;5.诺丹明外排实验显示:芹菜素增加SGC7901/VCR细胞内诺丹明蓄积和潴留,提示芹菜素可降低其细胞膜的药物转运功能;6. Western blot检测P-gp蛋白显示:芹菜素上调SGC7901/VCR细胞内P-gp的表达水平;7. Real-time PCR检测MDR1基因显示:芹菜素上调SGC7901/VCR细胞内MDR1的转录水平。8. PI染色法检测细胞周期分布显示:芹菜素和阿霉素单独作用下均具有细胞周期阻滞作用,而联合作用下细胞G2期阻滞作用增强;9. Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡显示:芹菜素和阿霉素单独作用下均诱导细胞凋亡,联合作用下细胞凋亡程度增加;10. Real-time PCR检测p53、p21基因显示:芹菜素和阿霉素单独作用均可诱导p21的表达增加,但联合作用p21的表达量更高,但对p53无明显影响。【结论】1.芹菜素对胃癌多药耐药细胞生长增殖的影响:芹菜素可抑制细胞生长,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡。因此,芹菜素对胃癌多药耐药细胞生长增殖具有抑制作用。2.芹菜素对胃癌细胞多药耐药性与药物转运功能的影响:芹菜素能够增加胃癌多药耐药细胞对化疗药物的敏感性,并且降低细胞膜P-gp的药物转运功能。3.芹菜素抑制胃癌多药耐药细胞生长和逆转胃癌细胞多药耐药性的分子机制:芹菜素下调MDR1基因的转录及其产物P-gp表达。4.芹菜素对化疗药物抗肿瘤作用的影响与机制:芹菜素增加阿霉素诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡,这可能与其通过非p53依赖途径上调p21的表达水平有关。
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