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[目的]分析miR-32、ITGA6的表达水平之间的相关性以及与NSCLC患者临床病理参数的相关性,并通过体外、体内实验研究miR-32靶向调节ITGA6表达在NSCLC生长和转移中的作用及其机制,为临床NSCLC诊治提供新的分子标志物和潜在的重要靶点。[方法]1、qPCR技术检测NSCLC患者癌组织、配对远端对照肺组织中miR-32的表达水平,收集整理患者临床病理参数。2、采用 miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors、pGpU6/GFP/Neo-miR-32,通过脂质体瞬时转染NSCLC细胞,荧光显微镜和qPCR评价转染效果;采用CCK实验、平板克隆实验、划痕实验、Transwell侵袭实验研究miR-32对NSCLC细胞增殖能力、成瘤能力、迁移和转移能力的影响。3、采用生物信息学分析软件(PITA、RNA22、TargetScan、picTar、miRanda、microT)和在线数据库分析miR-32潜在的靶基因;构建野生型和突变型ITGA6 3’UTR,与miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors共转染297T,进行双荧光素酶报告基因检测;miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors 通过脂质体瞬时转染 A549 和XWLC-05细胞后,qPCR和Western blot技术检测miR-32、ITGA6的表达水平;分析qPCR检测NSCLC患者肿瘤组织中miR-32与ITGA6表达水平之间的相关性;采用免疫组织化学技术检测NSCLC患者癌组织、配对远端对照肺组织中ITGA6、ITGB4的表达水平,收集整理患者临床病理参数;采用MTS实验、软琼脂克隆实验、Transwell体外侵袭和迁移实验等体外实验研究整合素α6β4对NSCLC细胞增殖能力、成瘤能力、转移和迁移能力的影响;采用裸鼠皮下移植瘤模型和SCID小鼠肺原位移植瘤模型,体内实验研究整合素α6β4在NSCLC生长和转移中的作用。4、通过慢病毒感染构建具有GFP和LUC标记稳定表达miR-32、miR-NC的A549细胞,并采用qPCR和Western blot技术检测miR-32、ITGA6表达水平,评价筛选结果;通过皮下注射GFP标记的实验组(LV-miR-32)、对照组(LV-miR-NC)的A549细胞,构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察裸鼠一般情况,测量裸鼠体重、瘤体大小。接种肿瘤细胞后22天时处死裸鼠,测量瘤体重量和大小,肿瘤组织一部分速冻,进行qPCR检测miR-32表达,另一部分10%中性甲醛固定,进行HE染色;通过尾静下注射LUC标记的实验组(LV-miR-32)、对照组(LV-miR-NC)的A549细胞,构建SCID小鼠肺转移模型。接种肿瘤细胞后30天进行小动物活体成像,并处死小鼠,肺组织固定后进行HE染色。5、miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors及其阴性对照通过脂质体瞬时转染A549 和 XWLC-05 细胞,qPCR 和 Western blot 技术检测 miR-32、ITGA6、FAK、pFAK、E-cadherin、Vimentin、SLUG 表达水平。并通过 Rescue 实验,qPCR 和Western blot 技术检测 miR-32、ITGA6、FAK、pFAK、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin、Vimentin、SLUG 表达水平,进一步研究 miR-32 在 NSCLC进展中的作用机制。[结果]1、miR-32在94例NSCLC组织中的相对表达量为0.79(0.14,1.71),而在配对远端对照肺组织中的相对表达量1.00(0.37,3.65),差异具有统计学意义(P<0.01);miR-32在37例宣威NSCLC组织中的相对表达量明显低于配对远端对照肺组织(P<0.05),而37例宣威NSCLC组织中miR-32相对表达量与57例非宣威NSCLC比较,差异无统计学意义(P>0.05);miR-32的表达水平与患者年龄、性别、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移、病理类型之间均没有相关性(分别P>0.05)。2、qPCR结果显示,miR-32在NSCLC细胞中的表达水平低于正常支气管上皮细胞16HBE,差异有统计学意义(分别P<0.01)。转染miR-32-5p mimics、pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC 细胞中 miR-32 的表达水平均高于阴性对照组(分别P<0.001)。CCK实验结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549、XWLC-05细胞增殖明显受到抑制(分别P<0.001),而转染miR-32-5p inhibitors的A549、XWLC-05细胞增殖率明显高于其阴性对照inhibitors NC(分别P<0.001)。平板克隆形成实验结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549、XWLC-05、H157细胞克隆数明显低于阴性对照组miR-NC(分别P<0.001)。划痕实验结果显示,转染 pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC细胞伤口愈合速度明显慢于阴性对照组(分别P<0.001)。Transwell侵袭实验结果显示,转染 pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC侵袭细胞数明显低于阴性对照组(分别P<0.001)。3、4 个数据库(PITA、TargetScan、miRanda、microT)预测 ITGA6 具有 miR-32的结合位点;双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-32-5p mimics可明显抑制野生型ITGA6 3’UTR质粒荧光素酶活性(P<0.001),而突变型ITGA6 3’UTR质粒活性则无明显变化(P>0.05)。相反,miR-32-5p inhibitors则可明显促进野生型ITGA6 3’UTR质粒荧光素酶活性(P<0.001);qPCR结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549和XWLC-05中miR-32表达水平均明显高于阴性对照组(分别P<0.001,P<0.05),而ITGA6表达水平均明显低于阴性对照组(分别P<0.01)。转染miR-32-5p inhibitor的A549和XWLC-05中miR-32表达水平则均明显低于阴性对照组(分别P<0.001,P<0.05),而ITGA6的表达水平均明显高于阴性对照组(分别P<0.001,P<0.01);Western blot 结果显示,转染 miR-32-5p mimics后,A549和XWLC-05中ITGA6蛋白的表达水平均低于阴性对照组。NSCLC肿瘤组织中miR-32和ITGA6的相对表达呈现负相关关系(r=-0.34,P<0.001);整合素α6β4在NSCLC肿瘤组织中的表达均高于配对远端对照肺组织(分别P<0.05,P<0.001)。整合素α6β4的表达均与NSCLC患者复发转移密切相关(分别P<0.01);整合素α6β4在NSCLC细胞株中均有表达。抑制整合素α6β4表达的实验组H460SM细胞软琼脂克隆形成率、迁移率、侵袭率均低于与阴性对照组(分别P<0.05);抑制ITGA6、ITGB4表达的实验组裸鼠皮下移植瘤体积小于阴性对照组(分别P<0.05);抑制ITGA6、ITGB4表达的的实验组SCID小鼠肺癌原位移植瘤转移率低于阴性对照组(分别P<0.05)。4、qPCR和Western blot技术检测稳定表达miR-32和miR-NC的A549细胞中miR-32、ITGA6的表达,结果显示实验组(A549/LV-miR-32)miR-32的表达均明显高于对照组((A549/LV-miR-NC),而ITGA6的表达则均明显低于对照组(分别P<0.001)。裸鼠皮下移植瘤模型结果显示,与对照组((A549/LV-miR-NC)比较,实验组(A549/LV-miR-32)小鼠皮下移植瘤增长趋势明显受到抑制,差异有统计学意义(P<0.01)。实验组移植瘤离体肿瘤重量、肿瘤体积均小于对照组(分别P<0.01,P<0.05)。qPCR结果显示,实验组移植瘤离体肿瘤miR-32表达水平明显高于对照组(P<0.01)。SCID小鼠尾静脉注射肺转移模型实验结果显示,对照组肺脏肿瘤结节数明显多于实验组(P<0.001)。5、瞬时转染 miR-32-5p mimics 的 A549 和 XWLC-05 细胞中 ITGA6、pFAK(Y397)、pFAK(Y925)、Vimentin表达水平均低于阴性对照组,E-cadherin则高于阴性对照组(分别P<0.05),而瞬时转染miR-32-5p inhibitors的A549和XWLC-05细胞中ITGA6、pFAK(Y397)、pFAK(Y925)、Vimentin 表达水平均高于阴性对照组,E-cadherin则低于阴性对照组阴性对照组(分别P<0.05);与miR-NC和过表达对照质粒瞬时共转染比较,miR-32-5p mimics和过表达对照质粒瞬时共转染A549和 XWLC-05 细胞,ITGA6 蛋白及其下游 pFAK(Y397)、pFAK(Y925)、p-AKT、p-ERKl/2表达水平降低,E-cadherin表达水平升高而Vimentin、SLUG表达水平降低(分别P<0.00l,P<0.0l)。与miR-32-5p mimics和过表达对照质粒瞬时共转染比较,miR-32-5p mimics和ITGA6过表达质粒瞬时共转染A549和XWLC-05细胞,可部分逆转由于miR-32-5p mimics所造成的ITGA6蛋白表达的抑制,增加下游 pFAK(Y397)、pFAK(Y925)、p-AKT(ser473)、p-ERK1/2(pT202/Y204)磷酸化蛋白表达水平,增加Vimentin、SLUG表达,降低E-cadherin表达。[结论]1、miR-32在NSCLC肿瘤组织中呈低表达,提示miR-32在NSCLC发生发展中可能发挥抑癌miRNA的作用。2、过表达miR-32可抑制NSCLC生长和转移。3、整合素α6β4信号通路可促进NSCLC生长和转移。ITGA6是miR-32新的靶基因。miR-32可抑制ITGA6表达,抑制整合素α6β4信号通路的活化,抑制AKT、ERK激活,降低SLUG的表达,进而抑制NSCLC的侵袭和转移。