论文部分内容阅读
藏药经典制剂七十味珍珠丸(然纳桑培,????徸?????????)具有安神镇静、通经活络、调和气血和醒脑开窍的作用,主要用于治疗“黑白脉病”、“龙血不调”、以及中风、瘫痪、半身不遂等疾病。由于其药效物质基础和作用机制均不清楚,故本文以GC-MS法研究其挥发油和脂溶性成分及其入血成分,以保护血脑屏障(BBB)为切入点,应用GC-MS和代谢组学方法研究其治疗脑缺血后BBB损伤的作用机制。目的:1.分析七十味珍珠丸中挥发油和脂溶性成分,发现特有化合物。2.分析七十味珍珠丸中入血成分,为药效物质基础研究提供参考。3.揭示七十味珍珠丸对脑缺血BBB的保护作用及作用机制。方法:1.水蒸气蒸馏法和溶剂萃取法分别提取七十味珍珠丸中挥发油和脂溶性成分,采用GC-MS法分离、鉴定,并测定各个化合物的相对百分含量,对结果进行聚类分析和主成分分析。2.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤(MCAO)模型,以正己烷处理大鼠血浆样品(脑缺血30min和24h),采用GC-MS法分离、鉴定,并测定各个化合物的相对百分含量。3.基于MCAO模型,测定脑组织的脑梗死比率(TTC染色)、伊文思蓝含量(EB染色)和尼氏小体数量(甲苯胺蓝染色);HE染色观察海马区病理形态;透射电镜观察神经元和BBB。4.基于MCAO模型,采用免疫荧光法(IF)测定大鼠缺血侧脑组织中MMP-9的蛋白表达量;RT-PCR法、WB法测定MMP-9、Claudin-5、Occludin的m RNA及蛋白表达量。5.基于MCAO模型,以正己烷法(脑缺血30min和24h)、衍生化法(脑缺血24h)处理大鼠血浆样品,采用GC-MS分离、鉴定,并测定各个化合物的相对百分含量,对结果进行主成分(PCA)和偏最小二乘判别(PLS-DA)分析。结果:1.鉴定出88个挥发油成分,以丁香酚、壬烷、1,4-二甲苯和β-桉叶醇为主,特有化合物41个。鉴定出63个脂溶性成分,以亚油酸、丁香酚、肉豆蔻酸和二十九烷为主,特有化合物29个。鉴定出19个共有成分(藏红花醛、枯茗醛、乙酸松油酯、丁香酚、α-蒎烯、甲基丁香酚、1-石竹烯、肉豆蔻醚、榄香素、桉油烯醇、氧化石竹烯、β-绿叶烯、T-杜松醇、β-桉叶醇、α-荜澄茄醇、红没药醇、麝香酮、新瑟模环烯和2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)。2.脑缺血30min时,鉴定出12个入血成分(壬烷、癸烷、十甲基环五硅氧烷、二十三烷、二十九烷、2,4-二叔丁基苯酚、二十六烷、二十一烷、二十八烷、二十七烷、2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、胆甾醇);脑缺血24h时,鉴定出11个入血成分(二十二烷、壬烷、十甲基环五硅氧烷、2,4-二叔丁基苯酚、二十六烷、十八烷、二十一烷、二十七烷、2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、胆甾醇)。3.七十味珍珠丸能降低大鼠的脑梗死比率,改善神经行为学异常,增加脑组织尼氏小体数量,降低脑组织伊文思蓝含量,减轻脑组织神经元和血脑屏障损伤,改善脑组织病理变化。4.七十味珍珠丸有降低大鼠缺血侧脑组织中MMP-9的蛋白表达和m RNA表达的趋势,增加Claudin-5、Occludin的蛋白表达和m RNA表达的趋势。5.脑缺血30min时(正己烷法),鉴定出3个差异代谢物(2,6-二叔丁基对甲酚、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸甲酯);脑缺血24h时(正己烷法),鉴定出2个差异代谢物(环己基甲基二甲氧基硅烷、2,6,10-三甲基十五烷);脑缺血24h时(衍生化法),鉴定出9个差异代谢物(α-D塔罗糖、N,N-二乙基乙酰胺、乳酸、二十三烷、甘油、肉豆蔻酸、4-甲基癸烷、1-甲基-2-吡咯烷酮、二十四烷)。结论:1.七十味珍珠丸中挥发油(桂皮醛、α-细辛脑等)、脂溶性成分(月桂酸、去氢木香内酯等)及入血成分(十甲基环五硅氧烷等)的分析和鉴定,为七十味珍珠丸的质量控制及药效物质基础研究提供参考。2.七十味珍珠丸对脑缺血致大鼠BBB超微结构及神经元损伤有明显的保护作用,其机制可能与MMP-9、claudin-5和occludin无关。3.七十味珍珠丸治疗缺血性中风的作用机制相关的差异代谢物有14个,主要与氧化应激反应、脂质代谢、脂肪酸代谢和能量代谢有关。