卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一,其中上皮性卵巢癌占原发性卵巢肿瘤50%～70%,目前认为上皮来源的卵巢癌是由一组不同形态及不同分子遗传特性的独立疾病所构成的一类肿瘤。透明细胞瘤是上皮性卵巢肿瘤中的一种,在东方女性中较西方更为常见。和其它类型的上皮性卵巢癌相比,透明细胞瘤大部分为恶性肿瘤,预后不佳,并且对化疗不敏感。故此,将卵巢透明细胞肿瘤当做一类独立肿瘤进行相关研究具有必要性。EPA(二十碳五烯酸)属于n-3多元不饱和脂肪酸,虽然人体内可以通过亚麻酸转化生产少量的EPA,但是人体所需EPA大部分仍然从食物中获取。一些学者对比了某些种类癌症患者和正常人血浆中的EPA的含量,发现前者血浆中EPA的含量明显低于正常人血浆,这一临床现象提示了EPA对肿瘤的发生发展起着某些作用。目前,在癌症恶病质患者中,摄入EPA可以维持和增加恶病质患者的体重,并且也能增加化疗敏感性。卵巢透明细胞癌由于其恶性程度高和对化疗不敏感,由此我们思考EPA是否也能影响卵巢透明细胞癌,目前在所有EPA和肿瘤的研究中,还没有研究证实过EPA和卵巢透明细胞癌的关系。在本实验研究中,通过对卵巢透明细胞系ES2的研究,证实了EPA可以有效抑制ES2的增殖,促进其凋亡。进而,本实验寻求了EPA影响卵巢透明细胞癌的相关机制。在近年研究中,脂肪酸可通过一系列的G蛋白偶联受体实现其各种生物学效应,包括对细胞膜的形成、膜受体的组成、信号转导通路、基因转录和炎症等方面,这一类G蛋白偶联受体也被称为脂肪酸受体(free fatty acid receptor, FFAR)。不同的FFAR对不同碳链长度脂肪酸的识别具有特异,例如FFAR1(GPR40)和GPR120是目前己报道的可以识别长链不饱和脂肪酸的FFAR,它们的Gα亚基均为Gaq/11。我们首先猜测GPR40和GPR120是否在ES2细胞中介导EPA的生物学效应,但实验证实ES2中GPR120和GPR40的表达量非常低,并且无法检测到Gα亚基激活后可引起的细胞质内Ca2+浓度上升。所以,我们探寻是否存在其它的G蛋白偶联受体可以在ES2细胞中介导EPA作用。GPR30是近年报道的一种新的雌激素受体,主要介导雌激素的快速非基因组效应,其α亚基为Gs,主要位于内质网膜上。GPR30和传统雌激素受体ERa、β没有同源性,但是其配体种类大致相同。其对17βE2产生3-6nM亲和力,但对17αE2、雌酮和雌三醇的亲和力非常低,而对孕酮、皮质醇和睾酮几乎没有结合力。此外,些合成的抗雌激素药物中,例如他莫昔芬和氟维司群(ICI182780),以及一些植物类雌激素,例如大豆,也均为GPR30的配体。当GPR30的配合和其结合之后,偶联的G蛋白被激活,分离为Gα和Gβγ异二聚体。Gβγ异二聚体可以激活Src和AC,前者可以通过一些列反应激活细胞膜上得EGFR受体,后者可以引起细胞内cAMP浓度上升,从而产生下游生物学效应。关于GPR30在组织学中的表达,其可在正常的乳腺、卵巢、子宫等组织中表达,也可在一些病理组织中表达,例如乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、甲状腺癌、前列腺癌和肺癌。其中,在卵巢癌中,GPR30的表达量和其预后相关。目前,关于GPR30所能引起的分子生物学效应及其机制的研究仍然很欠缺,在本文中,首次证明了EPA可以作为GPR30的配体,并且在ES2细胞中,EPA通过GPR30产生其各项生物学效应。第一部分EPA在体外影响卵巢透明细胞癌生长目的在体外条件下,从细胞增殖及细胞凋亡两方面,进行EPA对卵巢透明癌细胞系ES2影响的评估。方法在不同浓度(0-300uM)不同种类(棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、亚麻酸、二十碳五烯酸)的脂肪酸处理下,使用CellTiter 96(?) Aqueous Non-Radioactive试剂盒测试ES2细胞增殖；为排除脂肪酸对细胞产生脂毒性而抑制细胞生长,使用CCK-8细胞毒性测试对不同浓度不同种类脂肪酸加入ES2后进行检测,选择本实验所用的脂肪酸实验浓度；在实验浓度下,不同脂肪酸在不同时间内对ES2细胞增殖的影响；使用流式细胞仪检测加入EPA后ES2细胞凋亡的改变；使用RT-PCR检测加入EPA后ES2中促凋亡基因(bax、bim、puma)及抑凋亡基因(bcl-2, bcl-xl, survivin)的mRNA含量改变。结果EPA在300uM的浓度下不会对ES2细胞产生脂毒性。EPA对ES2细胞增殖具有剂量效应及时间效应；EPA可以促进ES2细胞凋亡,并且促进促凋亡基因表达(bax、bim、puma),降低抑凋亡基因表达(bcl-2, bcl-xl, survivin)结论EPA在体外可以影响卵巢透明细胞癌的生长,具体表现为抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。第二部分EPA通过GPR30影响卵巢透明细胞癌生长目的探求ES2中介导EPA主要生物学功能的受体。方法在加入Gq抑制剂Ym25486或不加的条件下,验证EPA和PAL已发现的受体GPR40和GPR120的下游效应,即细胞内钙离子浓度上升。此外,加入Ym25486后检测EPA对ES2的抑制增殖和促进凋亡效应是否有改变。使用RT-PCR检测己报道的各类脂肪酸受体和GPR30在ES2中的mRNA表达。利用脂肪酸-蛋白结合试验确定在ES2细胞中EPA是否可以直接结合于GPR30。通过siRNA和加入GPR30抑制剂G15的方法,探求GPR30是否为ES2中主要介导EPA作用的受体。通过western blot、cAMP浓度检测、RT-PCR方法验证EPA激活GPR30后的下游途径。结果未加入Ym25486时,EPA引起ES2中1.5倍的钙离子浓度改变,作为对比,PAL引起ES2中4倍的钙离子浓度改变。加入Ym25486后,EPA引起的ES2中钙离子浓度变化不因Ym25486而改变,作为对比,PAL引起的ES2中钙离子浓度上升收到Ym25486的抑制。相应地,Ym25486不影响EPA对ES2产生的抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的效应。GPR30在ES2中的表达量比其余已报道的脂肪酸受体明显高。并且在ES2细胞中,EPA可以直接识别GPR30。通过siRNA干扰GPR30表达或者加入GPR30抑制剂G15后,EPA对ES2产生的抑制增殖和促进凋亡效应均有明显恢复。EPA可以通过GPR30引起ES2中ERK和Akt磷酸化水平下降,并且引起cAMP浓度上升进而活化蛋白激酶A。结论已发现的长链脂肪酸受体GPR40和GPR120不是介导EPA在ES2中产生生物学效应的受体。GPR30可以作为EPA的受体,并且介导EPA在ES2中抑制增殖和促进凋亡的生物学效应。第三部分EPA在体内通过GPR30影响卵巢透明细胞癌生长目的验证在体内,EPA是否通过GPR30影响卵巢透明细胞癌ES2的生长。方法使用BALC/c雌性裸鼠构建ES2细胞皮下瘤模型。于裸鼠右侧腋部皮下2*106/200ul/只接种,每日观察裸鼠成瘤情况。将成瘤小鼠随机分为四组,NC组、NC+EPA组、shRNA组口shRNA+EPA组,其中shRNA组和shRNA+EPA组小鼠的皮下瘤通过shRNA干扰了ES2中GPR30表达。第五日开始进行EPA瘤周注射处理,NC+EPA组和siGPR30+EPA组中,每隔2日给予EPA 300uM 200ul局部瘤周皮下注射。于第14日解剖皮下瘤,测量肿瘤体积及重量,并进行免疫组化检测。结果第4日皮下可见类圆形肿块,直径约5mm。加入EPA处理后,裸鼠所荷肿瘤明显缩小。对比shRNA组和shRNA+EPA组,在干扰了GPR30表达之后,加入EPA后肿瘤大小没有明显变化。免疫组化结果提示,EPA不影响GPR30的表达,但加入EPA后,Ki67表达明显下降。干扰GPR30表达后,加入EPA并不引起Ki67表达改变。结论EPA可以在体内影响荷ES2细胞肿瘤的生长。