链霉菌TD-1代谢产生抑菌物质条件优化及分离纯化

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据国际粮农组织统计,全球范围内的粮食类农作物都会遭受致病真菌的侵害,造成严重的经济损失。链霉菌作为天然抑菌物质、活性物质和抗生素等的主要来源之一,在对真菌病害的防治方面起到至关重要的作用,天然抑菌物质替代传统化学方法,成为一种新型的生物防治手段,也受到各界研究者的广泛关注,成为领域热点话题。本论文研究结果表明,白黄链霉菌(Streptomyces Albofavus TD-1)次级代谢产物中含有能够对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、禾谷镰刀菌(Fusahum graminearum)、青霉菌(Penicillium digitatum)等多种农作物病原真菌起到抑制作用的活性产物。为实现链霉菌S.Alboflavus TD-1活性抑菌物质的规模化及工业化生产,本课题通过单因素实验,考察了不同工业碳源与氮源对S.Alboflavus TD-1活性抑菌物质产量的影响,结合牛津杯、薄层色谱与高效液相色谱等定性与定量分析方法发现工业碳源中马铃薯淀粉对S.Alboflavus TD-1发酵代谢活性抑菌物质促进能力最强,其次为可溶性淀粉;对发酵代谢产量促进效果最大的氮源为黄豆粉,其次为豆饼粉。其中,牛津杯法测得其对指示菌的抑菌率为66.7%,最佳的工业发酵培养基组分为:黄豆粉10 g/L,马铃薯淀粉20 g/L,硝酸钾1 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L,可溶性淀粉20g/L,氯化钠0.5g/L,硫酸镁0.5g/L,硫酸亚铁0.001g/L。经优化后的抑菌率达到73.97%,比未优化时提高了 38%。本论文采用高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography,HSCCC)对S.Alboflavus TD-1次级代谢物质进行分离纯化,研究Solsel软件辅助法筛选9种不同的溶剂分离体系,调整抑菌物质在不同体系中的分配比例,确定正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水=1:6:1:5,转速 850r/min,温度 25℃,流速 5min/mL 为分离S.Alboflavus.TD-1发酵抑菌产物的最优条件,分离得到的5种组分,其中2号组分有较强的抑菌性,用高效液相色谱法检测显示组分较纯,表明HSCCC可以对S.Alboflavus TD-1代谢产物进行快速、高通量的样品制备。本论文采用傅里叶红外光谱仪和高分辨IT-TOF液质联用仪对2号组分进行检测鉴定。发现2号组分除C、H、O元素外不含有其他基团元素,含有4种化合物,分子量分别是633.3997、633.4000、633.3961、633.3993,推测是结构相似的同类物质,推测可能化合物的化学式为C366H5609。
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