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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）可引起猪流行性腹泻病（Porcine epidemic diarrhea，PED），感染不同生长阶段猪，尤其对哺乳仔猪影响较大。自2010年以来，我国多个省份的猪场已大规模爆发PED，造成仔猪大量死亡。PEDV属于冠状病毒科、冠状病毒属，是有囊膜的单股正链RNA病毒，5端有一个帽子结构(cap)，3端有一个poly(A)尾，包含至少7个开放阅读框架，编码4个主要的结构蛋白，分别是纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N);三个非结构蛋白ORF1a/1b、ORF3。S基因编码的纤突蛋白(S)是位于病毒粒子表面的糖蛋白，具有良好的免疫原性，在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用，而辅助基因ORF3编码的非结构蛋白与病毒的毒力及致病性有关。PEDV已然成为我国规模化养猪场腹泻病的主要病原，开展PEDV的研究刻不容缓。 本研究旨在:(1)猪流行性腹泻病毒RT-nPCR和荧光定量PCR检测方法建立和应用;(2)探明浙江及周边地区猪流行性腹泻病毒S和ORF3基因的分子演化特征;(3)制备截短流行株PEDV S1蛋白多克隆抗体。 1.本研究建立了针对PEDV的RT-nPCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示，建立的PEDV RT-nPCR的检测下限为2×10-5pg/μL的模版cDNA，且具有较好的特异性;基于SYBR GreenⅠ的Real-time PCR检测方法敏感性为2.3×101copies/μL的模版cDNA。在2013年4月至2015年1月间，浙江省周边地区的8个地市，25家规模化养猪场的159份病料PEDV阳性率为49.7％(79/159)。 2.分离获得了PEDV CV777疫苗株。结果显示，在Vero细胞培养基中加入3μg/mL胰酶，可进行来源于三联四价的弱毒疫苗(PEDV-TGEV-PRV)中CV777的分离培养。Vero细胞感染CV77736 h-48 h后，可形成合胞体和细胞圆缩等明显的细胞病变。对CV777不同代次RT-nPCR、测序分析、电镜(Electronmicroscope，EM)和间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence，IFA)检测分析表明，分离培养的为PEDV CV777毒株。 3.研究选取PEDV感染严重、死亡率较高的6个猪场6株PEDV临床株进行S和ORF3基因全长克隆分析。6株PEDV分离株属于第Ⅲ群，与第Ⅰ群的CV777、SM98存在较远的亲缘关系;6株临床株的S、S1和S2基因与国内外参考毒株的同源性分别为93.8％-99.6％、91.7％-99.7％和96.2％-99.7％，氨基酸相似性分别为92.4％-99.7％、89.9％-99.7％和96.2％-100.0％;选取其中变异性较大的S1序列与经典毒株CV777、SM98、attDR13、virDR13进行比对，发现临床株在第58位至61位插入NQGV、在136位插入N、在225位碱基由E突变为Q等;N-糖基化位点分析，ZJ14NB0301，ZJ13LY1201以及ZJ13XS0401流行株存在28个N-糖基化位点，而SH131202，ZJ14HZ0301以及ZJ13SX1101与疫苗株CV777一样含有29个N-糖基化位点，但存在位置的差异。6株PEDV临床株的ORF3序列与参考毒株氨基酸同源性及核苷酸相似性分别为92.8％-100％、92.4％-100.0％，与致弱突变型attDR13的ORF3基因相比，存在部分片段的插入。 4.研究成功构建了3个截短流行株PEDV(ZJ13SX1101) S1蛋白的原核表达质粒，并获得了重组融合的His-S1T1(47-394aa)、His-S1T2(233-741aa)和MBP-S1T2(233-741aa)原核表达蛋白，以上述纯化的原核表达蛋白为抗原，分别制备了兔抗His-S1T1抗体、兔抗His-S1T2抗体和兔抗His-S1T1+His-S1T2抗体。以建立的MBP-S1T2为包被抗原的ELISA检测结果显示，兔抗His-S1T1抗体、兔抗His-S1T2和兔抗His-S1T1+ His-S1T2抗体效价分别为1∶6400、1∶3200和1∶12800。3个多克隆抗体经Western blot分析，均可与MBP-S1T2反应;经IFA分析，只有针对S1T1片段的抗体与CV777具有一定的反应性，但反应性较弱。 上述研究结果为开展PEDV分子检测、探明其分子演化特征提供了方法和数据，获得的抗流行株PEDV-S1多抗为下一步开展研究提供了素材。