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目的:伊立替康(CPT-11,Irinotecan)作为临床上转移性或晚期结直肠癌的一线治疗药物,却存在着严重的不良反应-迟发型腹泻。其治疗过程中病人出现腹泻的概率高达60%-80%,而严重腹泻可导致病人死亡。目前伊立替康所致的腹泻机理不清楚,目前主要认为其毒性与肠道组织中CPT-11的活性代谢产物SN38的浓度相关,而肠道组织中SN38的暴露主要受到外排转运蛋白调控。而CPT-11、SN38和SN38-G(SN38在体内的主要代谢途径是经UGT催化生成葡萄糖醛酸代谢物SN38-G)主要是经P糖蛋白(P-gp)、多药耐药性蛋白(MRP2)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等药物外排蛋白从胆汁或尿液排泄。胆汁中SN38被肠壁细胞吸收后重新进入肝脏进而被代谢为SN38-G并经胆汁排泄至肠腔,SN38-G经肠道菌群水解生成SN38,从而形成肝肠循环。这种循环延长CPT-11在肠腔中的半衰期,加重对肠壁刺激,从而加重腹泻。因而减少SN38在肠道中的暴露是解决CPT-11致腹泻的重要途径。目前有各种各样的策略通调节外排转运蛋白来防治CPT-11所致的腹泻例如环孢菌素和维拉帕米,但是环孢菌素和维拉帕米本身的不良反应严重限制了其临床应用,而中医药在治疗化疗药物的毒性方面有独特的作用。文献研究和初步研究表明,中药小柴胡汤能抑制P-gp或MRPs的功能,从而抑制SN38以及SN38-G从胆汁中排泄。因此,我们期望确定一种安全的中药小柴胡汤来调控伊立替康的体内处置过程,从而降低伊立替康所致的腹泻。方法:1.采用裸鼠皮下移植瘤模型,考察小柴胡汤对CPT-11药效以及腹泻的影响。HE病理学切片检查小肠和结肠的损伤。2.采用 Bcrp1(-/-),Mdr1a(-/-),Mrp1(-/-),Mrp2(-/-)基因敲除小鼠及其 FVB 背景鼠,Mrp3(-/-)基因敲除小鼠及其背景鼠C57小鼠行胆囊结扎术后进行尾静脉注射CPT-11(5mg/kg),收集胆汁1h(收集完毕后眼眶采血,取肝脏,肾脏)LC-MS/MS测定CPT-11及其代谢物胆汁及脏器组织浓度,以探讨外排转运蛋白对CPT-11及其代谢物在胆汁排泄的影响。同时,用FVB小鼠考察3.6 g/kg小柴胡汤与CPT-11(5mg/kg)联合用药后对CPT-11及其代谢物胆汁排泄的影响。3.采用Caco-2细胞模型考察CPT-11和SN38的双向跨膜转运特征。分别使用BCRP 蛋白抑制剂 Ko143(10 μM)、P-gp 蛋白抑制剂 Zosuquidar(1 μM)以及 MRP2蛋白抑制剂MK571(10 μM),考察三种外排转运蛋白抑制剂对CPT-11,SN38的双向转运的影响。另外还考察了 0.2 mg/ml,5 mg/ml的小柴胡汤,10μM,50μM的汉黄芩素(wogonin)和 5μM,20 μM 的柴胡皂苷 d(saikosaponin d,SSd)对 CPT-11,SN38在Caco-2细胞模型上跨膜转运的影响。4.小柴胡汤与CPT-11联合用药对CPT-11及其代谢物药代动力学影响将FVB小鼠分为两组,分别灌胃生理盐水和小柴胡汤3.6 g/kg,30min后尾静脉注射CPT-11(15mg/kg)后将小鼠放入小鼠代谢笼,在注射药物后5、15、30、60、120、180、240、360、480、720、1440min尾静脉取血(20～30μL)至涂有肝素的离心管中,弹打均匀保存至4℃冰箱。在0h、12h、24h、48h收集粪便和尿液,研究小柴胡汤对CPT-11药代动力学和排泄的影响。5.小柴胡汤对肠道β-葡萄糖醛酸酶活力的影响为考察小柴胡汤能否抑制β-葡萄糖醛酸酶(β-gus)对SN38-G的肠道水解,对照组小鼠粪便S9样品加入β-gus酶进行共孵育,小柴胡汤组的小鼠粪便S9样品加入β-gus酶后分别加入5 mg/ml和50 mg/ml的小柴胡汤澄清液(20μM微孔滤膜过滤)进行共孵育,阳性对照组小鼠粪便S9样品加入β-gus酶后同时加入0.1 mM的β-gus酶抑制剂葡萄糖二酸单内酯(SCL)进行共孵育。结果:1.小柴胡汤显著降低了伊立替康所致的腹泻。CPT-11连续给药6天后,CPT-11给药组腹泻的发生率第六天为60%,到达第七天为100%,其中重度致死性腹泻发生率为60%。给予小柴胡汤3.6 g/kg与CPT-11联合用药后,有效的抵抗了小鼠体重的下降,腹泻的发生率降低为20%且无重度腹泻发生。HE染色结果显示,小柴胡汤能有效对抗CPT-11对肠组织损伤。2.小柴胡汤对CPT-11抗肿瘤活性的影响结果显示,小柴胡汤和CPT-11联合用药未影响CPT-11的抗肿瘤活性,CPT-11单药用药组和小柴胡汤联合用药组肿瘤抑制率分别为69.2%和67.2%,两者无显著性差异。3.基因敲除小鼠胆汁排泄实验结果显示,Bcrp1(-/-)小鼠中的SN38,CPT-11胆汁排泄量分别显著下降102%(P<0.01),49.14%(P<0.05);Mdrla(-/-)小鼠的CPT-11胆汁排泄量显著下降53.5%(P<0.05);Mrp2(-/-)小鼠的SN38-G的胆汁排泄量显著下降85.6%(P<0.05)。Mrp3(-/-)小鼠的CPT-11胆汁排泄量显著上升48.5%(P<0.05)。结果分别与其相对应的背景鼠比较。4.5mg/kg CPT-11与3.6 g/kg小柴胡汤联合用药后,SN38的胆汁排泄量能显著降低1.72倍(P<0.05),SN38-G的胆汁排泄量极显著下降36倍(P<0.01),而对原型CPT-11的外排量无显著影响。5.P-gp转运蛋白抑制剂Zosuquidar分别显著增加了 CPT-11,SN38在Caco-2细胞模型上的AP-BL方向的表观渗透系数(Papp)3.5倍和2.35倍,外排率(ER)分别下降了 5.3和3.09倍。BCRP转运蛋白抑制剂Ko143显著降低SN38在BL-AP方向的转运量,外排率(ER)从9.34下降至5.21;Ko143对CPT-11的表观渗透系数以及外排率均无显著性影响。MRP2转运蛋白抑制剂MK-571对CPT-11和SN38的双向转运量,表观渗透系数以及外排率均无显著性影响。6.5 mg/mL小柴胡汤使CPT-11的外排率下降近3.41倍,SN38的外排率下降10.6倍。10μM,50μM汉黄芩素使CPT-11外排率分别下降1.7倍和2.6倍;5μM,20μM的柴胡皂苷d使CPT-11外排率分别下降1.2倍和2.1倍。另外,10μM,50μM汉黄芩素使SN38外排率分别下降2.31倍和1.17倍;5μM,20μM的柴胡皂苷d使SN38外排率分别下降3.5倍和3倍。7.小柴胡汤与CPT-11联合用药后CPT-11的Cmax和AUC0～t分别增加了 1.58倍和2.52倍,SN38的Cmax和AUC0～t分别增加了 1.47倍和2.30倍。CPT-11的MRT和T1/2分别增加了 4.20和2.10倍,SN38的MRT和T1/2分别增加了 2倍.所以CPT-11的血浆清除率下降到42.4%,而SN38为48.4%。但是SN38-G的药代动力学参数没有显著差异。小柴胡汤联合伊立替康(CPT-11)用药后,粪便及尿液总的排泄量从33.59±4.53%下降到24.93±5.48%,总量下降了 17.6%。粪便中SN38的排泄量降低了 30%,CPT-11的粪便排泄量下降了 20%,粪便中SN38-G的量增加了 10倍。8.小柴胡汤抑制β-葡萄糖醛酸酶对SN38-G的肠道水解。对照组小鼠粪便S9以及小柴胡汤联合给药组小鼠粪便S9进行体外孵育实验结果表明,与对照组比,小柴胡汤联合给药组粪便S9中的SN38的生成量从75.50±4.90%显著下降至53.60±4.60%。另外,我们还用β-葡萄糖醛酸酶与5 mg/ml,50 mg/ml的小柴胡汤对SN38-G(10μM)进行共孵育,结果表明SN38生成量分别极显著下降至3.24±0.03%和0.58±0.007%,50mg/ml组SN38生成量下降近100倍。结论:1.小柴胡汤可以有效降低CPT-11在治疗过程中腹泻的发生,并且不影响CPT-11的抗肿瘤活性。2.在CPT-11及其代谢物胆汁排泄过程中,BCRP主要介导SN38,CPT-11胆汁排泄进入肠腔;P-gp主要介导了 CPT-11胆汁排泄进入肠腔;Mrp2介导了 SN38-G的胆汁排泄进入肠腔;Mrp3介导了 CPT-11胆汁排泄进入血液循环系统。3.P-gp主要介导了 CPT-11在肠细胞的跨膜转运,BCRP主要介导了 CPT-11,SN38在肠细胞的跨膜转运。4.小柴胡汤通过抑制外排转运蛋白P-gp和BCRP的功能显著降低SN38,SN38-G的胆汁排泄量。5.小柴胡汤显著增加了 CPT-11及SN38在血液循环系统的暴露,并且抑制肠道β-葡萄糖醛酸苷酶的活力,抑制SN38-G在肠道的水解,降低SN38的生成量从而显著增加了 SN38-G的粪便排泄而显著降低了 SN38的粪便排泄。6.因此,小柴胡汤通过抑制外排转运蛋白的作用降低了 SN38,SN38-G从胆汁排泄到肠道,增加了 CPT-11及SN38在血液循环系统的暴露,并且通过抑制肠道β-葡萄糖醛酸苷酶的活力降低了 SN38在肠道内的暴露,有效的降低了 CPT-11所造成的腹泻。