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目的检测肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性以及耐药基因,了解耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的分子流行病学;掌握耐药基因bla NDM亚型在本地区的流行情况。探究NDM-1过表达菌株对RAW264.7细胞凋亡的影响,明确NDM-1对大肠埃希菌耐药性的影响以及过表达后细菌表达谱的变化。方法采用WHONET5.6软件对某三甲综合教学医院2014～2016年分离的肠杆菌科中耐亚胺培南的细菌进行初筛,采用肉汤稀释法检测细菌对碳青霉烯类抗生素的最低抑菌浓度;用PCR方法检测CRE耐药基因(bla NDM、bla KPC和bla OXA-48等)和CRE耐药相关基因(bla CTX-M-15),利用测序方法鉴定NDM亚型。通过构建pet28a(+)-NDM-1过表达载体,转化BL21(DE3)大肠埃希菌感受态细胞,根据三因素三水平进行正交试验设计来优化NDM-1的表达,用考马斯亮蓝染色和q RT-PCR方法检测NDM-1在感受态细胞中的表达情况;K-B法(纸片扩散法)检测pet28a(+)-NDM-1-BL21(DE3)菌株对亚胺培南等抗生素的耐药性,并观察亚胺培南联合黄连素后pet28a(+)-NDM-1-BL21(DE3)菌株敏感性的变化。将pet28a(+)-NDM-1-BL21(DE3)、pet28a(+)-BL21(DE3)和BL21(DE3)菌株分别感染RAW264.7细胞,构建细胞凋亡模型,用q RT-PCR检测凋亡相关基因Caspase-9、Apaf-1、Bax和Bcl-2的表达量;用pet28a(+)-NDM-1-BL21(DE3)、pet28a(+)-BL21(DE3)和BL21(DE3)菌株做转录组测序,观察将NDM-1耐药基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中过表达后相关基因上调或下调的情况。结果用WHONET5.6软件统计并筛选出92株耐碳青霉烯的肠杆菌科细菌(CRE),发现92株CRE主要来自肝胆外科、ICU和血管外科,标本来源主要为胆汁、痰和无菌中段尿;其中对阿米卡星的耐药率最低(12%),对其他抗生素耐药率均较高,对头孢呋辛和头孢唑啉的耐药率高达100%。应用PCR检测耐药基因,其中bla NDM、bla CTX-M-15、bla TEM和bla SHV检出率高,未检测出bla OXA-48耐药基因;测序发现59株NDM阳性菌中有35株为bla NDM-1,24株为bla NDM-5。构建NDM-1过表达载体后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),检测其蛋白表达和m RNA表达情况,发现在几个诱导条件下均有蛋白和m RNA的表达,并且发现加入IPTG后培养4h为其最佳诱导条件。K-B法检测到pet28a(+)-NDM-1-BL21(DE3)的耐药性在NDM-1过表达后,对四种抗生素由敏感变为耐药;联合药敏试验表明亚胺培南联合黄连素对pet28a(+)-NDM-1-BL21(DE3)为相加作用,而对临床分离菌株E.coli-73作用为无关作用。pet28a(+)-NDM-1-BL21(DE3)感染RAW264.7细胞后,发现NDM-1过表达菌株与阴性对照菌株均能引起细胞凋亡,凋亡相关基因在不同时间点两组的表达量有所差异(P<0.05)。pet28a(+)-NDM-1-BL21(DE3)、pet28a(+)-BL21(DE3)和BL21(DE3)的RNA-seq结果表明,pet28a(+)-NDM-1-BL21(DE3)与pet28a(+)-BL21(DE3)相比,有290个差异表达基因,其中122个表达上调,168个表达下调;290个差异表达基因中,有18个为已有功能注释与NDM-1表达相关的基因,这些基因主要参与“核苷酸结合”,多数为“ABC转运蛋白”家族,如opp D、gln Q和fec B等编码ABC转运蛋白的基因。结论(1)本地区2014-2016年CRE的耐药基因流行情况表明,CRE对头孢呋辛和头孢唑啉等多种抗生素具有较高的耐药性;耐药基因bla NDM在CRE中阳性率较高,而在本地区以bla NDM-1亚型为主。(2)NDM-1可以增强大肠埃希菌对IPM、MEM、CZO和CAZ四种抗生素的耐药作用;黄连素联合IPM对NDM-1过表达菌起到一定的抑菌作用。(3)NDM-1在大肠埃希菌中的表达会导致感染该菌后的细胞中凋亡相关基因Apaf-1、Caspase-9和Bcl-2/Bax的上调,从而影响该细菌对细胞凋亡的作用。(4)bla NDM-1在BL21(DE3)菌株中的表达能调控opp D、gln Q和fec B等多种与细菌耐药性和代谢相关的基因的表达,对宿主细胞有较强的影响作用。